[發(fā)明專利]一種快速確診貓白血病的檢測方法及其試紙條的制備

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201611186051.3
• 申請日: 2016-12-20
• 公開（公告）號: CN106841608A
• 公開（公告）日: 2017-06-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 秦雷;朱丹丹;張旭東;陳芳;沙森;許席席;彭雪婷;秦允震;卓雨晴;譚影影
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇雷森生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/533
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種用于貓白血病的快速確診的檢測方法及其試紙條的制備，屬于醫(yī)學(xué)檢驗領(lǐng)域。

背景技術(shù)

貓白血病病毒(FeLv)世界性貓感染的常見原因，并伴隨有較高的發(fā)病率和死亡率。貓白血病的常發(fā)病癥有惡性淋巴腫瘤、骨髓性白血病以及變性性胸腺萎縮和非再生性貧血等，其中對貓最嚴重的是惡性淋巴腫瘤。貓白血病病毒(FeLv)的特征在于會引發(fā)貓的終生感染，早期并不會出現(xiàn)明顯的癥狀，隨之會出現(xiàn)持續(xù)性的病毒血癥，后期治療十分困難，最終會產(chǎn)生致命的結(jié)果。在發(fā)病早期準確確診貓白血病并及時給予治療，是治愈貓白血病的最佳選擇。持續(xù)性感染的病貓成為了貓白血病病毒(FeLv)的直接傳染源，其唾液、糞便、尿、乳汁、鼻腔分泌物均含有病毒，通過呼吸道、消化道傳染到健康貓。將確診的病貓隔離是控制貓白血病病毒(FeLv)的有效途徑。因此，一種快速準確確診貓白血病的檢測方法是控制和治療貓白血病的關(guān)鍵。

貓白血病早期癥狀不明顯，僅僅根據(jù)臨床癥狀很難確診，要確診貓白血病，有效的檢測方法必不可少。目前，常用的檢測法有：血常規(guī)檢查、病理切片、酶聯(lián)免疫吸附、免疫膠體金技術(shù)等方法檢測病貓組織中的FeLV。其中血常規(guī)檢查和病理切片檢測檢測時間較長，起不到快速診斷的效果。酶聯(lián)免疫吸附的檢測成本相對較高，并且在檢測過程中影響因素較多，易出現(xiàn)假陽性結(jié)果，對于貓白血病的檢測，酶聯(lián)免疫吸附法準確度欠佳。同時，膠體金檢測信號較弱、靈敏度低等限制了其應(yīng)用。因此需要一種穩(wěn)定的，易操作，耗時短、靈敏度高的檢測方法用于貓白血病的確診。

發(fā)明內(nèi)容

基于此，本發(fā)明的目的在于一種易操作，耗時短、靈敏度高、定量檢測貓白血病病毒的方法及其試紙的制備，實現(xiàn)貓白血病早期病毒的快速檢測。此方法采用熒光定量側(cè)向免疫層析原理檢測貓全血，血漿，血清，唾液或眼淚中的貓白血病病毒(FeLv)。本發(fā)明所述的抗體標記的熒光微球可以是一種金屬膠體顆粒、一種磁顆粒，包括但不僅限于乳膠納米顆粒。此熒光微球標記的抗體，以熒光乳膠微球為例的制備方法，包括以下步驟：

(1)將定量的熒光乳膠微球溶液加到緩沖溶液中稀釋，超聲1.5min，得到熒光微球分散液。

(2)向步驟(1)中的熒光乳膠微球分散液中迅速滴入活化劑，快速置于渦旋振蕩器上低速震蕩1min后，固定在渦旋振蕩器上，室溫下震蕩活化30min。

(3)活化結(jié)束后，將步驟(2)中的熒光乳膠微球分散液在26℃，14000rpm下，離心12min后移去上清液，用步驟(1)中的緩沖溶液清洗，再次以相同條件離心后，棄去上清液，用步驟(4)中緩沖溶液復(fù)溶重懸。

(4)取FeLv單克隆抗體，加入緩沖溶液稀釋至0.06mg/mL。

(5)將步驟(3)中復(fù)溶的納米顆粒分散液加入到步驟(4)中的抗體稀釋液中，立刻在渦旋震蕩器上震蕩1.5min，隨后超聲1.5min，然后固定在渦旋振蕩器上在室溫下震蕩反應(yīng)1h。

(6)反應(yīng)結(jié)束后，將步驟(5)中溶液超聲1min，在26℃，14000rpm下，離心12min后移去上清液，加入封閉液，同樣然后固定在渦旋振蕩器上在室溫下震蕩反應(yīng)1h。

(7)將步驟(6)中溶液離心后再次加入封閉液清洗，在26℃，14000rpm下，離心12min后移去上清液，可得到熒光微球標記的抗體。

步驟(1)的緩沖溶液是2-(N-嗎啡啉)乙磺酸緩沖溶液，其pH為7.2。

步驟(2)中活化劑是EDC&NHS活化劑。

步驟(3)中復(fù)溶的緩沖溶液以及步驟(4)的緩沖溶液均是硼酸酸緩沖溶液，其pH值為7.8。

本發(fā)明還提供了一種基于上述方法制備的熒光微球標記的抗體的試紙條，其特征在于，試劑盒的結(jié)構(gòu)如圖1所示：在塑料底板(1)一端粘貼樣品墊(2)，樣品墊的一端緊密壓接噴涂有熒光微球標記的貓白血病病毒抗體的結(jié)合墊(3)，結(jié)合墊(3)一端緊密壓接硝酸纖維素NC膜(4)，NC膜上包被有檢測線T1(5)和質(zhì)控線C(6)，NC膜的另一端連接吸水墊(7)形成試紙，試紙裝入塑料卡殼內(nèi)形成試紙卡。包括以下組裝步驟：

(1)抗體標記的熒光微球中加入重懸液，反復(fù)吹打，隨后超聲5min直至沉淀完全溶解。

(2)將步驟(1)中的抗體標記的熒光微球溶液用劃膜噴金機噴涂于結(jié)合墊，隨后在烘箱中37℃下烘干1h。

(3)將對照線和檢測線要包被的抗體，分別用適宜的稀釋液稀釋后，用劃膜噴金機將其分別噴涂于硝酸纖維素膜上，37℃下在烘箱中烘干1h。

(4)組裝粘貼結(jié)合墊、樣品墊，密封過夜，使之充分粘合。