[發明專利]一種制備單克隆抗體的小鼠模型建立方法

在審

• 申請號: 201611182317.7
• 申請日: 2016-12-20
• 公開（公告）號: CN106719436A
• 公開（公告）日: 2017-05-31
• 發明（設計）人: 牛曉旭;趙巧輝;張文婧;李桂林;鄭艷麗;付光宇;吳學煒
• 申請（專利權）人: 鄭州伊美諾生物技術有限公司
• 主分類號: A01K67/027
• 分類號: A01K67/027
• 代理公司: 鄭州異開專利事務所(普通合伙)41114
• 代理人: 王霞

技術領域

本發明涉及單克隆抗體的制備技術，尤其是涉及一種可獲取大量鼠源性單克隆抗體的小鼠模型建立方法。

背景技術

1975年Kohler和Milstein建立了雜交瘤技術，將小鼠骨髓瘤細胞與產生綿羊紅細胞的小鼠脾細胞融合，形成的雜交瘤細胞既能產生抗體又能進行分裂繁殖，且產生的抗體只能識別一種抗原決定簇，稱為單克隆抗體。目前單克隆抗體主要應用于疾病的預防、診斷和治療，生物物質的純化及蛋白結構功能的研究中。治療性單抗（單克隆抗體）的市場在新藥開發中有逐年增長的趨勢，1997年單抗的銷售額是50億美金，以后每年都有40%到50%的增長，至2003年已達到1997年的十倍，達500億美金，由此可見單抗技術是生物技術領域中升起的一顆新星。

隨著對單克隆抗體藥物研究的不斷深入以及新藥的不斷推出，單克隆抗體藥一直處于較高的增長率。單克隆抗體不僅在體外診斷試劑上得以廣泛應用，還可直接用于對人類疾病的診斷、預防、治療以及免疫機制的研究，為人類惡性腫瘤的免疫診斷與免疫治療開辟了廣闊的前景。

我國的單克隆抗體藥物從無到有發展迅速，已在我國醫藥市場發揮著越來越重要的作用，但是單克隆抗體在我國市場仍屬高端產品，主要依賴進口。

目前在國內外實驗室廣泛采用的制備單抗的方法主要有兩大系統，一是體外培養法；二是動物體內生產法。

雜交瘤細胞系并不是嚴格的貼壁依賴細胞（anchorage dependent cell，ADC），因此既可以進行單層細胞培養，又可以進行懸浮培養。目前雜交瘤細胞的單層細胞培養法是各個實驗室最常用的體外培養手段，即將雜交瘤細胞加入培養瓶中，以含20%小牛血清的培養基培養，細胞濃度以1×10⁶-2×10⁶/ml為佳，然后收集培養上清，其中單抗含量約10-50ug/ml。顯然，這種方法制備的單抗量極為有限，無疑是不適用于單抗的大規模生產。要想在體外大量制備單抗，就必須進行雜交瘤細胞的大量（高密度）培養。因為單位體積內細胞數量越多，細胞存活時間越長，單抗的濃度就越高，產量就越大。目前對于雜交瘤細胞的大量培養方法包括以下幾種：

1、懸浮培養法：即小規模懸浮培養多采用轉瓶培養，通過攪拌使細胞呈懸浮狀態；而大規模懸浮培養多采用發酵式的生物反應器，美國、加拿大、法國和德國等幾家公司生產這類反應器，其培養方式可分為純批式、流加式、半連續式和連續式。

2、微載體培養法：微載體（Microcarrier）是以小的固體顆粒作為細胞生長的載體，在攪拌作用下微載體懸浮于培養液中，細胞則在固體顆粒表面生長成單層。可用作細胞大量培養的微載體主要以交聯瓊脂糖或葡聚糖、聚苯乙烯、玻璃等作為基質的產品，其中以Cytodex I，Biosilon和Superbeads為好。

3、中空纖維細胞培養系統：該系統由中空纖維生物反應器、培養基容器、供氧器和蠕動泵等組成。盡管該培養系統在大規模生產單抗時成本較低，并可獲得高產量高純度的抗體，但是由于設備價格昂貴，限制了其使用范圍。

4、微囊化細胞培養系統：該系統是先將雜交瘤細胞微囊化，然后將此具有半透膜的微囊置于培養液中進行懸浮培養，一定時間后，從培養液中分離出微囊，沖洗后打開囊膜，離心后即可獲得高濃度的單抗。

5、雜交瘤細胞的無血清培養：雜交瘤細胞的體外培養絕大多數應用DMEM或RPMI-1640為基礎培養基，添加10-20%胎牛或新生小牛血清。由于血清中含有上百種的蛋白質，這給單抗的純化帶來很大麻煩，而未純化的含有異種蛋白的單抗用于動物治療可誘發變態反應。無血清培養的實質就是用各種不同的添加劑來代替血清，然后進行雜交瘤細胞的培養。采用無血清培養基培養雜交瘤細胞制備單抗，有利于單抗的純化，有助于大規模生產，可減少細胞污染的機會，且成本較低。但無血清培養細胞的生產率低、細胞密度小，影響了單抗的產量；同時無血清培養基還缺少血清中保護細胞免受環境中蛋白酶損傷的抑制因子等。

雖然以上體外培養生產單抗的方法隨著技術的不斷發展會趨于更加完善，但依然無法代替從動物體內獲取單克隆抗體。