[發明專利]黃野螟過氧化氫酶全長序列及其克隆方法

在審

• 申請號: 201611181605.0
• 申請日: 2016-12-12
• 公開（公告）號: CN107287220A
• 公開（公告）日: 2017-10-24
• 發明（設計）人: 林同;程杰;陳敬祥;蔡紫玲;劉琪司
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N9/08;C12N15/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于生物基因工程技術領域，涉及到黃野螟過氧化氫酶基因全序列及其克隆方法。該基因編碼過氧化氫酶，該酶(CAT)是一類廣泛存在于動物、植物和微生物體內的抗氧化酶，是生物建立防御系統的關鍵酶之一，其生物學功能是催化細胞內過氧化氫的分解，具有重要的生物化學研究價值。

技術背景

過氧化氫酶(Catalase，CAT)與超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD) 和過氧化物酶(Peroxidase，POD)共同組成生物體抗氧化酶體系，清除細胞內的自由基。其中過氧化氫酶，又稱為觸酶，是以鐵卟啉為輔基的結合酶。它可促使H2O2分解為分子氧和水，清除生物體內的過氧化氫，從而使細胞免于遭受H2O2的毒害，是生物防御體系的關鍵酶之一。 CAT作用于過氧化氫的機理實質上是H2O2的歧化，必須有兩個H2O2先后與CAT相遇且碰撞在活性中心上，才能發生反應。H2O2濃度越高，分解速度越快。對該基因的研究為可以作為靶標設計新型氧化酶抑制劑提供了基礎。

黃野螟(Heortia vitessoides)屬鱗翅目(Lepidoptera)，螟蛾科(Pyralidae)，在我國廣泛分布于廣東、廣西、海南和云南等南方各省以及香港特別行政區。黃野螟是典型的寡食性害蟲，僅取食沉香屬(Aquilaria)和漆樹屬(Rhus)等少數幾種植物近年來，隨著海南、廣東和云南等地人工大規模種植白木香面積的日益擴大，黃野螟的危害也越來越嚴重。據廣東化州地區統計，黃野螟發生嚴重時，白木香的被害株率可高達90％以上。有關黃野螟過氧化氫酶基因目前無人研究，本發明填補了這一空白，對深入研究黃野螟體內保護酶系活性與殺蟲劑、昆蟲病毒、微孢子蟲等外界刺激強度相互作用關系以及昆蟲耐藥性和抗逆性提供基礎。

發明內容

本發明的目的在于提供黃野螟過氧化氫酶基因全序列及其克隆方法。

為了實現上述發明目的，本發明采取了以下技術方案：

1、黃野螟總RNA的提取

將外地采集的黃野螟活成蟲經清洗、消毒、麻醉、液氮冷凍后保存在無菌去酶的 EP管中，并置于-70℃低溫冰箱內保存備用。采用E.Z.N.A.^TMTotal RNA Kit II總RNA提取試劑盒(OMEGA)來提取黃野螟的總RNA。

2、引物設計和3′RACE擴增

在本實驗室構建的cDNA文庫中，查找并獲得了黃野螟過氧化氫酶基因的5′端序列，本發明是在此基礎之上進行3′RACE擴增，目的在于獲得黃野螟過氧化氫酶基因全序列。

3′RACE擴增的特異性引物為：

HV-CAT-3′-Outer：AAAAACGGGAGCACCAGT；

HV-CAT-3′-Inner：CGCTGATGCCAAGAAACG。

3、目的基因克隆及測序

獲得的PCR產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，回收相應目的DNA片段，同pMD20-T 載體進行連接，將連接后的產物轉化到E.coli DH5α感受態細胞之中，然后進行AMP抗性藍白斑的篩選，挑取合適的陽性菌落進行質粒提取。最后經由菌落PCR鑒定后進行測序。

4、序列拼接

將測序正確的序列與實驗室已構建的黃野螟cDNA文庫中的過氧化氫酶基因序列進行不重復拼接，從而獲得黃野螟過氧化氫酶基因全長序列。

黃野螟過氧化氫酶基因全長序列，此序列如下：

此序列中劃線處標示的atg為初始密碼子，劃線處標示的taa為終止密碼子。

根據黃野螟過氧化氫酶酶基因ORF(Open reading frame)全序列，得到其氨基酸序列。該序列如下：

本發明獲得了黃野螟過氧化氫酶基因全序列，通過對黃野螟成蟲的預處理、總RNA 的提取、3′RACE擴增、目的基因片段的克隆及其序列的拼接，得到了黃野螟過氧化氫基因全長序列，該序列全長2039bp，ORF序列全長1524bp，共編碼507個氨基酸。

具體實施方式

以下實施例將本發明進一步說明。

1、黃野螟總RNA提取