[發明專利]黃野螟酪氨酸羥化酶全長序列及其克隆方法

在審

• 申請號: 201611181604.6
• 申請日: 2016-12-12
• 公開（公告）號: CN107287219A
• 公開（公告）日: 2017-10-24
• 發明（設計）人: 程杰;林同;陳敬祥;蔡紫玲;劉琪司
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N9/02;C12N15/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于生物基因工程技術領域，涉及到黃野螟酪氨酸羥化酶基因全序列及其克隆方法。該基因編碼酪氨酸羥化酶，該酶是研究黑色素水平調控的重要材料，具有重要的害蟲防治意義。

技術背景

酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)以酪氨酸為底物能夠在四氫生物喋呤 (tetrahydrobiopterin，)作為輔因子存在的條件下催化酪氨酸形成多巴，然后在多巴脫羧酶(dopadecarboxylase，DDC)的作用下使多巴轉化成多巴胺，繼而在一系列酚氧化酶和輔因子的作用下形成黑色素。已有的研究表明，黑色素是昆蟲斑紋和體色形成的重要色素源，而昆蟲斑紋和體色對于昆蟲適應環境、預防天敵及后代繁殖等起著重要作用。作為黑色素合成的關鍵酶，酪氨酸羥化酶對昆蟲是十分重要的酶。該基因除了控制昆蟲體內黑色素的形成外，還是外骨骼硬化及變態發育的關鍵基因，對昆蟲的正常發育起重要作用。

黃野螟(Heortia vitessoides)屬鱗翅目(Lepidoptera)，螟蛾科(Pyralidae)，在我國廣泛分布于廣東、廣西、海南和云南等南方各省以及香港特別行政區。黃野螟是典型的寡食性害蟲，僅取食沉香屬(Aquilaria)和漆樹屬(Rhus)等少數幾種植物近年來，隨著海南、廣東和云南等地人工大規模種植白木香面積的日益擴大，黃野螟的危害也越來越嚴重。據廣東化州地區統計，黃野螟發生嚴重時，白木香的被害株率可高達90％以上。有關黃野螟酪氨酸羥化酶基因目前無人研究，本發明填補了這一空白，對深入研究黃野螟黑色素水平調控及黃野螟防止新方法奠定了基礎。

發明內容

本發明的目的在于提供黃野螟酪氨酸羥化酶基因全序列及其克隆方法。

為了實現上述發明目的，本發明采取了以下技術方案：

1、黃野螟總RNA的提取

將外地采集的黃野螟活成蟲經清洗、消毒、麻醉、液氮冷凍后保存在無菌去酶的 EP管中，并置于-70℃低溫冰箱內保存備用。采用E.Z.N.A.^TMTotal RNA Kit II總RNA提取試劑盒(OMEGA)來提取黃野螟的總RNA。

2、引物設計和3′RACE擴增

在本實驗室構建的cDNA文庫中，查找并獲得了黃野螟酪氨酸羥化酶基因的全序列 5′端序列，本發明是在此基礎之上進行3′RACE擴增，目的在于獲得黃野螟酪氨酸羥化酶基因全序列。

3′RACE擴增的特異性引物為：

HV-TH-3′-Outer：TGCGTGACGGTATGGGAT；

HV-TH-3′-Inner：ACGCCAACTCTCCATTCC。

3、目的基因克隆及測序

獲得的PCR產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，回收相應目的DNA片段，同pMD20-T 載體進行連接，將連接后的產物轉化到E.coli DH5α感受態細胞之中，然后進行AMP抗性藍白斑的篩選，挑取合適的陽性菌落進行質粒提取。最后經由菌落PCR鑒定后進行測序。

4、序列拼接

將測序正確的序列與實驗室已構建的黃野螟cDNA文庫中的酪氨酸羥化酶基因序列進行不重復拼接，從而獲得黃野螟酪氨酸羥化酶基因全長序列。

黃野螟酪氨酸羥化酶基因全長序列，此序列如下：

此序列中劃線處標示的atg為初始密碼子，劃線處標示的tga為終止密碼子。

根據黃野螟酪氨酸羥化酶基因ORF(Open reading frame)全序列，得到其氨基酸序列。該序列如下：

本發明獲得了黃野螟酪氨酸羥化酶基因全序列，通過對黃野螟成蟲的預處理、總 RNA的提取、3′RACE擴增、目的基因片段的克隆及其序列的拼接，得到了黃野螟酪氨酸羥化酶基因全長序列，該序列全長2220bp，ORF序列全長1677bp，ORF序列共編碼558個氨基酸。

具體實施方式

以下實施例將本發明進一步說明。

1、黃野螟總RNA提取

黃野螟成蟲采自廣州市華南農業大學啟林區土沉香林。經清洗、消毒、麻醉、液氮冷凍后保存在無菌去酶的EP管中，并置于-70℃低溫冰箱內保存備用。