[發明專利]一種改進的轉氨酶及其在(R)-3-氨基丁醇制備上的應用

有效

• 申請號: 201611181535.9
• 申請日: 2016-12-20
• 公開（公告）號: CN106754806B
• 公開（公告）日: 2020-04-14
• 發明（設計）人: 高新星;陸麗英;竺偉
• 申請（專利權）人: 尚科生物醫藥（上海）有限公司
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N15/54;C12N1/21;C12P13/00;C12R1/19
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本發明涉及一種改進的轉氨酶、編碼基因及其在(R)?3?氨基丁醇制備上的應用。該改進的轉氨酶的酶活性高于野生型轉氨酶的酶活性，野生型轉氨酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，來源于土曲霉菌Aspergillus terreus NIH2624，改進的轉氨酶包含與SEQ ID No.2所示氨基酸序列有至少95％序列同源性的氨基酸序列，且對應于SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第215位為脯氨酸殘基。其中改進的轉氨酶用于制備(R)?3?氨基丁醇的反應條件溫和，產物手性純度及收率均較高，底物濃度高達50g/L，具有較好的工業應用前景。

技術領域

本發明屬于生物制藥領域，具體涉及一種改進的轉氨酶、編碼基因及其在(R)-3-氨基丁醇制備上的應用。

背景技術

(R)-3-氨基丁醇在化學反應和藥物合成方面有著廣泛的應用，可作為多種手性藥物的關鍵中間體。比如抗HIV藥物度魯特韋(Dolutegravir)，該藥由葛蘭素史克(GSK)研發生產，2013年8月12日獲美國食品和藥物管理局(FDA)批準上市。度魯特韋自上市以來銷售額呈現飛躍式發展，2015年度全球銷售額高達90億美元。

(R)-3-氨基丁醇常溫常壓下是一種無色黏稠液體，分子量為89.14，可溶于水、乙醇、乙酸乙酯等溶劑中，其結構式如下所示：

目前公布的(R)-3-氨基丁醇的合成方法以化學法為主，一種是采用動力學拆分法獲得手性純的3-氨基丁醇(Journal of Organic Chemistry,42,1650,1977)，該方法產品收率低，反應過程采用四氫鋁鋰作為還原劑，工業化放大生產較危險。另一種是以手性化合物作為起始原料，如D-丙氨酸或R型苯乙胺通過多步反應獲得手性純的3-氨基丁醇(Tetrahedron,61,9031,2005和CN 101417954B)，這一類方法中手性純原料價格較貴，且反應步驟冗長，生產成本較高。

與化學合成法相比，生物合成法具有反應條件溫和、轉化率高和立體選擇性強等優點，目前利用生物法制備(R)-3-氨基丁醇的報道還較少。轉氨酶能夠不對稱催化潛手性酮類化合物一步合成手性胺類化合物，具有較好的應用前景。專利CN 104131048A公開了一種利用野生型D-轉氨酶不對稱催化4-羥基-2丁酮合成(R)-3-氨基丁醇的方法，但其反應底物濃度最高僅為300mM(26.4g/L)，無法滿足工業化生產需求，僅停留在實驗室研究階段，同時反應過程中需使用10％的有機助溶劑DMSO或乙腈，這也增加了反應后處理的操作和成本，工業三廢排放量加大。

發明內容

為了克服現有技術所存在的上述缺陷，本發明提供了一種改進的轉氨酶，同時還公開了該轉氨酶的編碼基因、重組表達基因工程菌及其在(R)-3-氨基丁醇制備上的應用。

本發明第一方面提供了一種改進的轉氨酶，其酶活性高于野生型轉氨酶的酶活性。

所述酶活性是指催化酮類化合物發生不對稱轉氨反應生成手性胺的酶活性。

所述野生型轉氨酶氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，且來源于土曲霉菌Aspergillus terreus NIH2624。

在本發明的一個具體實施例中，所述酶活性是指催化底物4-羥基-2-丁酮發生不對稱轉氨反應生成(R)-3-氨基丁醇的酶活性。

所述改進的轉氨酶是在SEQ ID No.2所示氨基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸殘基衍生的具有轉氨酶催化活性的蛋白質，且與SEQ ID No.2所示氨基酸序列有至少95％序列同源性。其中，所述的“幾個”是指2-15個，更佳地小于10個。根據本發明，在如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的蛋白質分子中進行2、5、10個氨基酸殘基的突變得到SEQ ID No.4、6、8所示氨基酸序列的蛋白質均具有較高的轉氨酶的活性。