[發(fā)明專利]一種凝血酶的檢測方法

有效

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• 申請日: 2016-12-19
• 公開（公告）號: CN106770163B
• 公開（公告）日: 2019-10-25
• 發(fā)明（設計）人: 薛彬;常鈺磊;張友林;劉曉敏;涂浪平;孔祥貴
• 申請（專利權）人: 中國科學院長春光學精密機械與物理研究所
• 主分類號: G01N21/65
• 分類號: G01N21/65;G01N1/28
• 代理公司: 北京集佳知識產(chǎn)權代理有限公司 11227
• 代理人: 趙青朵

本發(fā)明屬于分析化學領域，具體涉及一種凝血酶的檢測方法及檢測凝血酶的組合物。本發(fā)明所述組合物包括標記有核酸適配子的銀納米三角片和標記有核酸適配子的上轉(zhuǎn)換納米粒子；所述銀納米三角片上標記的核酸適配子和上轉(zhuǎn)換納米粒子上標記的核酸適配子為與凝血酶特異性結合的核苷酸序列。本發(fā)明所述檢測方法將標記有核酸適配子的銀納米三角片溶液與標記有核酸適配子的上轉(zhuǎn)換納米粒子溶液混合均勻，得檢測體系；在所述檢測體系中加入待檢測樣品，進行拉曼光譜檢測。本發(fā)明所述檢測方法具有檢測靈敏度高，成本低，背景熒光干擾小，方法簡單，便于操作等優(yōu)點。

技術領域

本發(fā)明屬于分析化學領域，具體涉及一種凝血酶的檢測方法及檢測凝血酶的組合物。

背景技術

凝血酶是一種由凝血酶前體形成的絲氨酸蛋白質(zhì)水解酶，具有催化纖維蛋白原變成纖維蛋白、促進血液凝固和調(diào)控凝血等作用，在揭示腫瘤的發(fā)生機制及作為早期診斷、療效及愈后判斷依據(jù)等方面有著非常重大的意義。由于血液中凝血酶的濃度達10nmol/L，建立簡單、快速、高靈敏度檢測凝血酶的方法具有非常重要的意義。

目前國內(nèi)外凝血酶的檢測方法包括電化學方法、熒光檢測方法、局域表面等離子體共振(LSPR)探測等。其中電化學方面通常較復雜，檢測靈敏度在百納摩爾水平已是極限。熒光檢測通常在可見光范圍激發(fā)，容易激發(fā)生物體內(nèi)有機分子，產(chǎn)生強背景干擾，無法進行在體檢測。而LSPR檢測相對較簡便，例如基于貴金屬金銀納米粒子的LSPR探測可以實現(xiàn)裸眼檢測，但裸眼檢測僅在大濃度范圍有效，靈敏度仍在1.6nM以上水平。

上轉(zhuǎn)換納米粒子發(fā)光檢測具有高靈敏度、無光漂白、低熒光背景等特性，在生物/化學檢測領域有重要應用。例如韓國Kim教授利用上轉(zhuǎn)換納米粒子實現(xiàn)對血紅蛋白的檢測(Anal.Chem.2016,88,2742-2746)。而利用上轉(zhuǎn)換納米粒子檢測凝血酶的方法通常采用有機分子、碳納米點、金納米粒子等作為發(fā)光受主實現(xiàn)檢測。然而凝血酶在血液內(nèi)，濃度僅有納摩爾水平，以上述材料作為受主，由于其消光系數(shù)低，導致檢測靈敏度低(僅到達納摩爾水平)。并且，血液具有極強的背景熒光干擾，產(chǎn)生熒光背景信號進一步降低檢測靈敏度。

因此，研發(fā)一種檢測靈敏度高、熒光背景低的凝血酶檢測方法，成為人們亟待解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容

鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種凝血酶的檢測方法，以解決現(xiàn)有凝血酶檢測方法存在的靈敏度低、背景熒光高等問題。

為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術方案：

一種檢測凝血酶的組合物，包括標記有核酸適配子的銀納米三角片和標記有核酸適配子的上轉(zhuǎn)換納米粒子；所述銀納米三角片上標記的核酸適配子和上轉(zhuǎn)換納米粒子上標記的核酸適配子為與凝血酶特異性結合的核苷酸序列。

優(yōu)選的，所述銀納米三角片上標記的核酸適配子為5’端帶有巰基的與凝血酶特異性結合的核苷酸序列；所述上轉(zhuǎn)換納米粒子上標記的核酸適配子為5’端帶有羧基的與凝血酶特異性結合的核苷酸序列。

優(yōu)選的，所述銀納米三角片上標記的核酸適配子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述所述上轉(zhuǎn)換納米粒子上標記的核酸適配子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

優(yōu)選的，所述標記有核酸適配子的銀納米三角片的制備方法為將銀納米三角片與核酸適配子溶液混合過夜后離心，將離心后的沉淀分散于This緩沖溶液中。

優(yōu)選的，所述標記有核酸適配子的上轉(zhuǎn)換納米粒子的制備方法為上轉(zhuǎn)換納米粒子去配體后與核酸適配子溶液混合后離心，將離心后的沉淀分散于Tris緩沖溶液。

本發(fā)明還提供了一種凝血酶的檢測方法，包括如下步驟：

1)將標記有核酸適配子的銀納米三角片溶液與標記有核酸適配子的上轉(zhuǎn)換納米粒子溶液混合均勻，得檢測體系；

2)在所述檢測體系中加入待檢測樣品，進行拉曼光譜檢測。