[發(fā)明專利]一種篩選抗豬圓環(huán)病毒病豬的miR-122啟動(dòng)子區(qū)分子標(biāo)記育種方法及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201611176306.8
• 申請(qǐng)日: 2016-12-19
• 公開（公告）號(hào): CN106591453B
• 公開（公告）日: 2020-06-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 姜運(yùn)良;張萍;孫億;劉根;鹿紅宇;王巖超;王昱丁;馬才
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/6888
• 分類號(hào): C12Q1/6888
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• 代理人: 暫無(wú)信息

本發(fā)明涉及分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，具體涉及了一種豬miR?122基因的啟動(dòng)子區(qū)突變位點(diǎn)的分子標(biāo)記方法及其在豬抗豬圓環(huán)病毒病育種中的應(yīng)用，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在不同品種豬中miR?122的啟動(dòng)子區(qū)存在多處差異，其中－4845位點(diǎn)處存在7bp堿基的插入/缺失，通過熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)，有7bp堿基插入的啟動(dòng)子熒光素酶活性顯著高于7bp堿基缺失的啟動(dòng)子熒光素酶活性。可見通過檢測(cè)豬基因組中miR?122基因啟動(dòng)子區(qū)－4845位點(diǎn)的基因型作為與豬抗豬圓環(huán)病毒病性狀相關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記，不僅方法簡(jiǎn)便快速，而且不受環(huán)境影響，并可實(shí)現(xiàn)早期選種。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，具體涉及了一種篩選抗豬圓環(huán)病毒病豬的育種方法，通過判斷豬ssc-miR-122的啟動(dòng)子區(qū)突變位點(diǎn)的多態(tài)性來(lái)進(jìn)行選種，并人為的應(yīng)用該突變位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)優(yōu)良育種。

背景技術(shù)

自1982年Tischer等在PK15細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus,PCV)以來(lái)，對(duì)其的研究已有約34年的歷史。PCV分為無(wú)致病性的PCV1和強(qiáng)致病性的PCV2兩種亞型。PCV2主要感染5～15周齡的豬，致死率約為15％。它是引起斷奶后仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PWMS)、呼吸道疾病綜合征(PRDS)、豬皮炎腎炎綜合征(PDNS)的主要病原(Stevenson etal.,2001)。PCV2感染機(jī)體后能引起免疫抑制，在與其它病原體一同共感染或繼發(fā)感染時(shí)，將會(huì)加重病情，嚴(yán)重的則會(huì)造成機(jī)體死亡。豬的抗病性狀屬于中等遺傳力水平的閾性狀，對(duì)病毒引起的疾病所產(chǎn)生的抗性是可以遺傳的。Opriessnig等的研究發(fā)現(xiàn)，在感染PCV2后，皮特蘭豬所表現(xiàn)出的臨床癥狀最為嚴(yán)重，長(zhǎng)白豬次之，杜洛克豬和大白豬的癥狀表現(xiàn)相對(duì)較輕。同時(shí)，本研究團(tuán)隊(duì)前期的研究發(fā)現(xiàn)在感染PCV2后，大長(zhǎng)雜交豬表現(xiàn)出日增重減慢、體溫升高、腹瀉、皮膚出現(xiàn)紫斑以及肺臟和脾臟出現(xiàn)充血、出血等癥狀，而萊蕪豬卻表現(xiàn)溫和，無(wú)明顯病變。以上結(jié)果表明不同品種豬對(duì)PCV2的抗性存在遺傳差異，地方品種豬抗PCV2的能力較強(qiáng)。豬不同品種間對(duì)PCV2的抗性存在遺傳差異，這為抗豬圓環(huán)病毒病豬的育種提供了基礎(chǔ)和前提。

萊蕪豬具有抗病耐粗、多胎高產(chǎn)、哺育力強(qiáng)、肉質(zhì)好等優(yōu)良特性。調(diào)查顯示，自2000年以來(lái)，在西方豬種PCV2感染率及死亡率呈逐漸升高的趨勢(shì)，而我國(guó)地方品種萊蕪豬未出現(xiàn)PCV2感染的報(bào)道，表現(xiàn)出對(duì)PCV2強(qiáng)的抗感染能力。本研究團(tuán)隊(duì)利用數(shù)字表達(dá)譜測(cè)序?qū)Ρ攘丝共⌒詮?qiáng)的萊蕪豬和易感的大長(zhǎng)雜交豬感染PCV2后肺臟組織表達(dá)譜的差異，篩選出大量差異表達(dá)的microRNA，實(shí)時(shí)定量RT-PCR試驗(yàn)驗(yàn)證了攻毒后的萊蕪豬的肺臟中miR-122表達(dá)量顯著高于未攻毒萊蕪豬；而在大長(zhǎng)雜交豬中的表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定(圖1)。這提示了ssc-miR-122基因 可能與豬圓環(huán)病毒病的抗性有關(guān)。

miR-122是一種專一表達(dá)于成年人肝臟的miRNA，位于人的18號(hào)染色體上，在一個(gè)肝臟特異性表達(dá)的轉(zhuǎn)錄單元內(nèi)，而豬miR-122位于1號(hào)染色體。miR-122是一個(gè)較長(zhǎng)前體非編碼基因轉(zhuǎn)錄本通過剪切后而產(chǎn)生，啟動(dòng)子具有較高的保守性，miR-122前體基因啟動(dòng)子區(qū)位于miR-122保守莖環(huán)序列上游約5kb處，包含多個(gè)核受體因子結(jié)合序列，如RNA聚合酶II所識(shí)別的啟動(dòng)子順式元件TATA-box等，利用報(bào)告基因系統(tǒng)結(jié)合生物信息學(xué)分析以及序列刪除和突變技術(shù)，確定了這些元件對(duì)于miR-122基因表達(dá)具有十分重要的調(diào)節(jié)作用。MiR-122有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，并可參與肝細(xì)胞發(fā)育、肝細(xì)胞表型、分化代謝和肝細(xì)胞應(yīng)急應(yīng)答等多種生理活動(dòng)。

通過對(duì)比萊蕪豬和大長(zhǎng)雜交豬miR-122基因的啟動(dòng)子區(qū)系列，找到多處核苷酸序列的不同。對(duì)－4845位點(diǎn)存在的7bp堿基插入/缺失的多態(tài)進(jìn)行了進(jìn)一步研究。我們的研究表明miR-122基因－4845位點(diǎn)的7bp堿基缺失后，熒光素酶報(bào)告基因活性顯著降低，提示該位點(diǎn)的7bp堿基插入可能有增強(qiáng)miR-122基因轉(zhuǎn)錄的功能。由于miR-122的穩(wěn)定表達(dá)和豬抗圓環(huán)病毒病相一致，因此通過檢測(cè)該分子標(biāo)記，選擇miR-122高表達(dá)的豬只組建基礎(chǔ)群進(jìn)行育種，對(duì)于提高豬群體的抗圓環(huán)病毒病特性具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容