[發(fā)明專利]用于熒光液滴檢測中熒光強度數(shù)據(jù)的處理方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201611176179.1
• 申請日: 2016-12-19
• 公開（公告）號: CN106596489B
• 公開（公告）日: 2019-06-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉聰;董文飛;黎海文;張濤;蔣克明;周武平
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 北京遠(yuǎn)大卓悅知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11369
• 代理人: 韓飛

本發(fā)明公開了一種用于熒光液滴檢測中熒光強度數(shù)據(jù)的處理方法，其用于基于熒光液滴的核酸檢測，包括以下步驟：1)獲取所有熒光液滴的熒光強度的數(shù)據(jù)，并進(jìn)行預(yù)處理；2)對數(shù)據(jù)進(jìn)行首次分類，3)根據(jù)首次分類的結(jié)果得出陰性液滴和陽性液滴熒光強度分布；4)計算最終判決閾值t；5)利用所述判決閾值t對數(shù)據(jù)進(jìn)行二次分類；6)計算樣品濃度。本發(fā)明的方法對數(shù)字PCR熒光微滴熒光強度分布進(jìn)行了準(zhǔn)確描述，能夠在無需陰性對照的情況下自動確定合適的閾值從而識別陽性微滴的數(shù)量，能有效提高數(shù)據(jù)分類的準(zhǔn)確率，從而能顯著提高熒光液滴檢測結(jié)果的精確性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及用于熒光液滴檢測中熒光強度數(shù)據(jù)的處理方法技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種基于熒光液滴的核酸檢測的陽性液滴自動識別方法。

背景技術(shù)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術(shù)，具有特異性強、靈敏度高、操作簡便、省時等特點。它可用于基因分離、克隆和核酸序列分析等基礎(chǔ)研究。數(shù)字PCR是近年來發(fā)展迅速的新一代定量PCR分析技術(shù)，利用微流控技術(shù)將大量稀釋后的核酸溶液分散至芯片的微反應(yīng)器中，每個反應(yīng)器的核酸模板數(shù)少于或者等于1個。這樣經(jīng)過PCR循環(huán)之后，有至少一個核酸分子模板的反應(yīng)器就會給出熒光信號，沒有模板的反應(yīng)器就沒有熒光信號。根據(jù)相對比例和反應(yīng)器的體積，就可以推算出原始溶液的核酸濃度。與傳統(tǒng)的熒光定量PCR相比，具有高靈敏度、高特異性、無需標(biāo)準(zhǔn)定量曲線等優(yōu)點。數(shù)字PCR技術(shù)提出至今，相關(guān)技術(shù)和產(chǎn)業(yè)化發(fā)展都非常迅速，迄今為止，數(shù)字PCR技術(shù)主要有三類:微反應(yīng)室孔板、大規(guī)模集成微流控芯片和液滴數(shù)字PCR系統(tǒng)。

早期的數(shù)字PCR采用96/384孔板作為反應(yīng)單元，隨著對測試靈敏度和準(zhǔn)確度的要求不斷提高，反應(yīng)單元的數(shù)目不斷增加，使得操作的復(fù)雜度和所需試劑量也成倍增加。大規(guī)模集成微流控芯片技術(shù)的出現(xiàn)為數(shù)字PCR分析提供了一個低成本、小體積和高通量平行分析的方案。液滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)源于乳液PCR技術(shù)，通過油水兩相間隔得到的以液滴為單位的PCR反應(yīng)體系，比微孔板和集成微流控芯片系統(tǒng)更容易實現(xiàn)小體積和高通量，而且系統(tǒng)簡單，成本低，因此成為理想的數(shù)字PCR技術(shù)平臺。

液滴微流控芯片是近年來在微流控芯片基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的操縱微量液體的技術(shù)。與傳統(tǒng)微通道芯片相比，微液滴的體積更小(10^-9L-10^-12L)，可靈活操控，尺寸均一，形狀可變，傳熱傳質(zhì)性能優(yōu)秀，并具有高通量分析的良好潛力。將液滴微流控技術(shù)應(yīng)用在生化分析領(lǐng)域，常使用熒光標(biāo)記感興趣的細(xì)胞或分子，通過識別帶熒光液滴檢測樣品中待測物濃度。因此準(zhǔn)確地確定熒光閾值對最終結(jié)果具有重要影響，目前基于熒光微滴PCR核酸檢測的閾值確定方法有兩種，一種是使用無待測樣品的陰性質(zhì)控品，通過統(tǒng)計該質(zhì)控品中微滴的最大熒光強度決定判別閾值，這種判決方法的識別準(zhǔn)確性高，但需要參考陰性質(zhì)控；另一種則基于Kmeans聚類算法，該方法無需對比，但由于熒光微滴的分布并非簡單兩類，而存在多種干擾，最終結(jié)果往往出現(xiàn)較大偏差。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于針對上述現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種用于熒光液滴檢測中熒光強度數(shù)據(jù)的處理方法。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種用于熒光液滴檢測中熒光強度數(shù)據(jù)的處理方法，其用于基于熒光液滴的核酸檢測中液滴的自動識別，尤其可用于液滴式樣品的熒光檢測中的熒光液滴的自動識別，包括以下步驟：

一種用于熒光液滴檢測中熒光強度數(shù)據(jù)的處理方法，其用于基于熒光液滴的核酸檢測，其特征在于，包括以下步驟：

1)獲取所有熒光液滴的熒光強度的數(shù)據(jù)，并進(jìn)行預(yù)處理；

2)對所述步驟1)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行首次分類，得到陽性液滴和陰性液滴的首次分類范圍，所述首次分類的方法包括傳統(tǒng)聚類算法或基于模型的聚類算法；