[發明專利]一種提高胞內氧化型輔酶I含量的方法

有效

• 申請號: 201611175056.6
• 申請日: 2016-12-19
• 公開（公告）號: CN106635943B
• 公開（公告）日: 2019-09-03
• 發明（設計）人: 穆曉清;徐巖
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12P19/36;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 彭素琴

本發明公開了一種提高胞內氧化型輔酶I含量的方法，屬于輔因子工程技術領域。本發明主要針對大腸桿菌中NAD⁺生物合成途徑，共表達合成NAD⁺的多個關鍵基因，同時在重組菌株有氧發酵過程中添加不同的前體物質，提高大腸桿菌胞內氧化型輔酶I的含量。從而使胞內NAD⁺含量達到最大化，為解決高效利用底物、增加目標產物和提高NAD(H)依賴型生物催化反應效率等問題提供思路和方案。

技術領域

本發明涉及一種提高胞內氧化型輔酶I含量的方法，屬于輔因子工程技術領域。

背景技術

輔酶I，又稱煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide)，是一種傳遞電子(氫離子)的輔酶，KEGG數據庫顯示NADH/NAD⁺作為重要的輔因子全程參與微生物細胞內的740多個代謝反應，包括氧化還原反應、能量代謝過程、調控基因表達、維持Ca⁺穩態以及調節細胞衰老等，尤其在糖酵解、糖異生、三羧酸循環和呼吸鏈中發揮著不可替代的作用。NAD⁺能為代謝網絡中各種反應提供能量和氧化還原力，其濃度可以調控代謝網絡途徑，增大代謝流通量，提高氧化還原反應中生物催化效率和目標產物的產率等。

NAD⁺生物合成主要有兩條途徑：從頭合成途徑和補救合成途徑(圖1)。從頭合成途徑以天冬氨酸或色氨酸為前體，通過一系列步驟生成喹啉酸(QA)，接著經基因nadC編碼的喹啉酸磷酸核糖轉移酶催化生成煙酸單核苷酸(NaMN)，再由基因nadD編碼的腺苷轉移酶催化腺苷化生成煙酸腺嘌呤二核苷酸(NaAD)，最后在基因nadE編碼的NAD⁺合成酶催化下氨基化成NAD⁺。補救途徑是基因pncA編碼的煙酰胺酶水解煙酰胺生成煙酸，再經基因pncB編碼的煙酸磷酸核糖轉移酶催化煙酸生成煙酸單核苷酸(NaMN)，最后生成NAD⁺。當細胞內大量存在NAD⁺前體煙酰胺(NAM)、煙酸(NA)時，補救途徑對胞內NAD⁺的含量起到重要的作用。

目前，提高細胞內NAD⁺含量主要從代謝工程和生化工程兩個方向上考慮，其中包括：過量表達NADH代謝相關酶、缺失NADH競爭途徑、引入NADH外源代謝途徑、添加外源電子受體、不同氧化還原態底物及NAD合成前體物、調節培養環境和氧化還原電勢等。

大腸桿菌由于遺傳背景清楚、易操作、易調控、培養基要求簡單且生長周期短等優點，被廣泛應用于科研工作中。然而，其細胞內的輔酶含量較低，無法起到增強相關催化反應效率的作用。因此，通過基因工程的手段增強細胞內NAD⁺含量對于提高胞內氧化型輔酶I的含量具有重要作用。

發明內容

本發明的第一個目的是提供一種共表達pncA、pncB、nadC、nadD、nadE中至少兩個基因的重組大腸桿菌。

在本發明的一種實施方式中，所述重組大腸桿菌以E.coli BL21為宿主。

在本發明的一種實施方式中，所述重組大腸桿菌是共表達pncA、pncB、nadC、nadD、nadE中的任意三種基因。

在本發明的一種實施方式中，所述重組大腸桿菌共表達pncA、nadD、nadE基因。

在本發明的一種實施方式中，所述重組大腸桿菌共表達pncB、nadE、nadD基因。

在本發明的一種實施方式中，所述重組大腸桿菌共表達nadC、nadD、nadE基因。

在本發明的一種實施方式中，所述重組大腸桿菌共表達pncB、nadE、pncA基因。