[發明專利]一種證明硫化氫與縫隙連接關系的實驗方法

有效

• 申請號: 201611169906.1
• 申請日: 2016-12-16
• 公開（公告）號: CN106771242B
• 公開（公告）日: 2019-09-06
• 發明（設計）人: 李新芝;馬克濤;彭珉
• 申請（專利權）人: 石河子大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/50
• 代理公司: 北京方圓嘉禾知識產權代理有限公司 11385
• 代理人: 董芙蓉

本發明公開了一種證明硫化氫與縫隙連接關系的實驗方法，該方法包括以下步驟：動物血壓測量；大鼠外周血淋巴細胞懸液制備；外周血T淋巴細胞亞群和Cx40、Cx43的檢測。本發明首次公開了硫化氫與T淋巴細胞上連接蛋白的關系，提示硫化氫通過影響免疫細胞間的縫隙連接通訊，調節炎癥因子的釋放，從而在改善高血壓炎癥所致的靶器官損傷中發揮了重要作用。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體地說，涉及一種證明硫化氫與縫隙連接關系的實驗方法。

背景技術

外周血淋巴細胞根據生物學功能和細胞表面抗原表達分為3個群：T淋巴細胞(CD3+)、B淋巴細胞(CD19+)和NK淋巴細胞【自然殺傷細胞(natural killer)，CD3-CD16+和/或CD56+】。T細胞又分為輔助T細胞(CD3+CD4+)和抑制T細胞(CD3+CD8+)。淋巴細胞亞群分析是檢測細胞免疫和體液免疫功能的重要指標，它總體反應機體當前的免疫免疫功能、狀態和平衡水平，并可以輔助診斷某些疾病，如自身免疫病、免疫缺陷病、惡性腫瘤、血液病、變態反應性疾病等，分析發病機制，觀察療效及檢測預后有重要意義。臨床上發現間隙連接蛋白40基因Cx40(-44和+71位點)多態性與原發性高血壓(EH)有一定的相關性。

目前，現有技術中，還沒有證明硫化氫與縫隙連接關系的實驗方法的相關報道。

發明內容

本發明的目的在于克服上述技術存在的缺陷，提供一種操作簡便、成本低廉的證明硫化氫與縫隙連接關系的實驗方法。

其具體技術方案為：

一種證明硫化氫與縫隙連接關系的實驗方法，包括以下步驟：

步驟1、動物血壓測量

使用全自動大小鼠無創血壓測量儀檢測WKY大鼠、SHR和硫化氫干預組三組大鼠尾動脈收縮壓。測量時先預熱，將血壓計的充氣尾套套在大鼠尾根部，待大鼠安靜后，重復測量血壓3次，結果取其平均值。

步驟2、大鼠外周血淋巴細胞懸液制備

將大鼠麻醉狀態下，采集腹主動脈外周血，置于10g/LEDTA真空采血管內。外周血進行離心，將血清和血細胞分離開，在血細胞中加至少一倍的PBS溶液，充分混勻，將稀釋后的血細胞輕鋪于等量淋巴細胞分離液上，1500r、30min，抽取云霧狀于1.5ml離心管中，1800r、6min，棄上清，PBS溶液重懸，備用。

步驟3、外周血T淋巴細胞亞群和Cx40、Cx43的檢測

取流式專用染色管，各組大鼠按照順序分別標記為空白、測定管和同型對照管，各管分別加入相應流式抗體，依據抗體說明書調整抗體終濃度，并設立陰性對照。室溫避光孵育30min，上機使用CELLQuest軟件進行檢測。標記CD4-APC和CD8-PE的管中加入固定劑120μL,4℃孵育30min，再用破膜buffer破膜，根據說明書參考濃度加入山羊抗大鼠Cx40抗體和FITC標記的兔抗山羊IgG，FITC同型對照，和小鼠抗大鼠Cx43抗體和FITC標記的山羊抗小鼠IgG，FITC同型對照，37℃孵育30min，上機使用CELLQuest軟件進行檢測。將流式細胞儀調整至最佳工作狀態，以FSC/SSC設門并排除死細胞和細胞碎片，根據同型對照調整好實驗參數后再進行樣本測定，首先設門于CD3+淋巴細胞，然后設門于CD4+和CD8+細胞，破膜后的淋巴細胞設門于CD4+和CD8+，然后設門于Cx40+、Cx43+細胞，所有樣本均在2h內完成對細胞的檢測，每管檢測20000個細胞，計算機讀出測定值，最后對收集的數據進行分析。

進一步，步驟3中所述的相應流式抗體具體為：CD3-FITC，FITC同型對照；CD4-APC，APC同型對照；CD8-PE，PE同型對照；山羊抗大鼠Cx40抗體和FITC標記的兔抗山羊IgG，FITC同型對照；小鼠抗大鼠Cx43抗體和FITC標記的山羊抗小鼠IgG，FITC同型對照。