[發明專利]一種利用小鼠腎細胞系統評價眼刺激性的方法

有效

• 申請號: 201611167524.5
• 申請日: 2016-12-16
• 公開（公告）號: CN106834410B
• 公開（公告）日: 2020-03-24
• 發明（設計）人: 程建華;鄭華生;張鵬;謝培鎮;謝明容;陳杰烽;黃桂州;何衍健
• 申請（專利權）人: 華南協同創新研究院
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 李衛東

本發明公開了一種利用小鼠腎細胞系統評價眼刺激性的方法，適用于化妝品原料刺激性的評價，尤其適用于表面活性劑的眼刺激性評價。該方法利用受試物對細胞有刺激性時，細胞收縮，完全融合的細胞受到破壞，當熒光素作用于受損的細胞膜時根據漏出的熒光素量間接反映細胞膜的破壞程度，從而表征受試物的刺激性大小。該方法所用受試材料種群穩定，來源可靠，且融合速度快，容易形成細胞生長培養膜，為試驗的穩定性提供保證；當用小鼠生細胞系統用于表面活性劑刺激性損傷評價時，與兔眼動物實驗的結果相關性好。

技術領域

本發明涉及一種利用小鼠腎細胞系統評價眼刺激性的方法，適用于化妝品原料刺激性的評價，尤其適用于表面活性劑的眼刺激性評價。

背景技術

表面活性劑是一種重要的精細化工產品，在國內外被廣泛應用，它被譽為“工業味精”，能使溶液表面張力顯著下降。表面活性劑廣泛應用于化妝品調制、食品加工、農藥和醫藥加工、紡織印染及洗滌劑生產等許多工業領域。表面活性劑用于生產化妝品或洗滌劑時，與消費者眼睛接觸的幾率大大增加，往往對消費者的眼睛存在一定刺激性甚至腐蝕性。

家兔眼刺激試驗(Draize test)是檢測化學物眼刺激性的經典方法，近年來，隨著實驗動物使用3R原則的倡導與實施以及生物醫學研究模式的轉變，替代動物實驗的體外模型研究已經成為毒理學評價的趨勢。根據體內眼損傷發生的機理，目前尚在開發的眼刺激替代方法可分為細胞系統、雞胚、人工角膜和離體器官四類，與其它三類相比，細胞系統標準化程度最高、成本最低而且快速。細胞系統替代內動物實驗的原理是基于大多數具有眼刺激作用的物質也具有細胞毒性，因此可根據化學物質對細胞膜損傷和對細胞質內蛋白質大分子破壞的相關性建立體外方法。用于體外測試的細胞包括成纖維細胞、血細胞、犬腎細胞等，目前基于標準化實驗動物小鼠腎細胞系統建立的體外方法還未見相關專利和文獻報道。

發明內容

為了克服上述現有技術的缺點與不足，本發明的首要目的在于提供一種利用小鼠腎細胞系統評價眼刺激性的方法，該方法準確性高、快速、簡便、成本低、對檢測儀器無特殊要求。

本發明所提供的利用小鼠腎細胞系統評價眼刺激性的方法，是通過檢測暴露于受試物后熒光素鈉漏出單/多層小鼠腎細胞的熒光素量來評價受試物的刺激性。其中，用于定量評價受試物對小鼠腎細胞損傷的指標為熒光素漏出量，其可用熒光分光光度計(激發光波長485nm，發射光波長530nm)定量測定。

本發明的目的通過下述方案實現：

一種利用小鼠腎細胞系統評價眼刺激性的方法，包括以下步驟：

一、小鼠腎細胞的制備

取小鼠腎臟上皮，剪碎，研磨后用培養液沖洗，收集液體，經150目不銹鋼網篩沖洗并收集網上腎細胞，加1g/L膠原酶I消化培養，37℃消化，每隔5min振蕩1次，15min后加等體積含有10％牛胎血清的培養液終止消化，吹打分散細胞后靜置5min，1000r/min離心5min，去除上清液，加入含10％牛胎血清的培養液，置于培養箱培養(37℃、5％CO₂)至細胞長滿培養皿的85％以上，消化、凍存備用；

二、小鼠腎細胞生長培養膜的制備

取步驟一中凍存備用的對數生長期的小鼠腎細胞，調節細胞濃度為4×10⁵～10×10⁵個/mL，取0.5mL加入到插入式培養皿中的微孔濾膜表面上培養72～96h(37℃、5％CO₂)，待細胞完全融合(細胞鋪滿整個微孔濾膜表面)后，得到小鼠腎細胞生長培養膜；

三、熒光素滲漏試驗

3.1檢測范圍確定實驗