[發明專利]局部微環境改變對外周神經損傷修復影響的實驗研究

在審

• 申請號: 201611167354.0
• 申請日: 2016-12-16
• 公開（公告）號: CN106596973A
• 公開（公告）日: 2017-04-26
• 發明（設計）人: 李佳雪
• 申請（專利權）人: 李佳雪
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本專利涉及局部微環境（免疫學）改變對外周神經損傷修復影響的實驗研究。

背景技術

周圍神經損傷后，遠側段全程及近側段局部軸突及髓鞘發生變性、崩解，引起大量炎性細胞聚集，產生多種細胞因子，這些細胞因子參與到周圍神經損傷修復再生的各個階段，對神經再生的質量及速度有著重要作用。

髓磷脂堿性蛋白(myelin basic protein，MBP)是存在于中樞神經系統髓質內的主要蛋白，是引起中樞神經系統炎癥的主要自身抗原，轉化生長因子（Transforming Growth Factor-β，TGF-β）TGF-β是一種極強的免疫調節劑，能抑制多種免疫反應，對單核巨噬細胞等炎性細胞具有極強的趨化性。

軸突生長抑制因子(Nogo)抑制軸突生長的特性更是廣為人知，但實際上，適當的Nogo蛋白的存在，卻起到確保神經生長準確性的作用 。

外周神經損傷后，損傷局部區域出現的免疫反應能否得到有效控制從而更有利于神經再生，目前尚未有明確結論。

本研究即是針對上述問題，通過動物實驗，探究外周神經損傷后，“血-神經屏障”破壞，局部免疫環境改變情況下，影響外周神經損傷修復的分子生物學機制，為臨床上制定更有特異性和有效的治療方案提供依據 。

發明內容

TGF-β在正常組組織細胞表達弱陽性；在對照組及實驗組，TGF-β均有明顯表達，但隨時間推移逐漸降低，NOGO-a在正常組及對照組組織細胞中幾乎無表達；實驗組坐骨神經內NOGO-a陽性表達，1周<2周>4周。

神經損傷后髓磷脂堿性蛋白（MBP）與多肽轉化生長因子（TGF-β）同時促進神經修復，而軸突生長抑制因子（NOGO-a）高表達稍滯后，在于保證神經修復生長的準確性。

實驗證實，MBP在正常組及對照組組織細胞中都有表達，但在實驗組MBP呈現較強的表達，說明在外周神經損傷、“血-神經屏障”破壞，局部區域內免疫環境發生改變的過程中，有MBP的原因存在TGF-β通過調節細胞周期因子、轉錄因子、生長因子、粘附分子和細胞基質基因的啟動、轉錄、降解等環節而實現其促進或抑制細胞生長的功能。

實驗中觀察，外周神經損傷發生后，TGF-β具有明顯的表達，其意義可能是多方面的。

一方面TGF-β可發揮其本身特有的生物學效應，直接參與細胞的增殖分化、代謝和內外間質的形成，促進組織修復，另一方面，作為一種極強的免疫調節劑，TGF-β還可能抑制在外周神經損傷、“血-神經屏障”破壞，由MBP等引發的局部區域內免疫環境的改變，從而更有利于神經修復。軸突生長抑制因子(Nogo)抑制軸突生長的特性更是廣為人知，但實際上，適當的Nogo蛋白的存在，卻有利于神經纖維正常生長。

實驗中觀察，外周神經損傷發生后，損傷部位出現Nogo-a的高表達，但其表達的峰值稍滯后，說明Nogo-a的高表達的意義，可能在于確保神經再生的準確性。

具體實施方式

4只Wistar大鼠隨機分為實驗組(n=20)，假手術組(n=20)和正常對照組(n=4)實驗組橫斷右側坐骨神經后，行神經外膜端端吻合。

假手術組僅游離出坐骨神經，然后關閉切口；正常對照組不做任何處理。

于術后1,2,4周時取術側坐骨神經， H-E染色并采用SABC免疫組化方法檢測坐骨神經內髓磷脂堿性蛋白（MBP）、軸突生長抑制因子（NOGO-a）、多肽轉化生長因子（TGF-β）的表達，并對染色結果進行統計學分析。

實驗試劑，多聚賴氨酸、S-P法免疫組化試劑盒、MBP鼠單克隆抗體、TGF-β鼠單克隆抗體、Nogo-a鼠單克隆抗體、DAB顯色劑。

實驗方法：HE 染色、MBP免疫組化染色 、TGF-β免疫組化染色 、Nogo-a免疫組化染色。

統計學分析，使用OLYMPAS BX-50多功能顯微鏡觀察并照相。運用顯微圖像分析系統（Simple PCI）測定組織內反應產物的平均光密度值，結果用x±s表示，并對所得數據利用SPSS10.0統計學軟件進行Q檢驗。

結果，MBP免疫組化染色，MBP在正常組及對照組組織細胞中即有明顯表達；在實驗組MBP則呈現較強的表達；但經統計學分析(Q檢驗)，組內比較差異無統計學意義。

不同時間點實驗組MBP免疫組化染色，經統計學分析(Q檢驗)，組內比較差異無統計學意義。