[發明專利]抗腫瘤海鞘多肽CS5931凍干粉針制劑及其制備方法

在審

• 申請號: 201611159150.2
• 申請日: 2016-12-15
• 公開（公告）號: CN106619543A
• 公開（公告）日: 2017-05-10
• 發明（設計）人: 林秀坤;鄭蘭紅;許煥麗;劉曉卉
• 申請（專利權）人: 首都醫科大學
• 主分類號: A61K9/19
• 分類號: A61K9/19;A61K38/17;A61K47/26;A61P35/00;C12N15/70;C07K14/435;C07K1/18;C07K1/16
• 代理公司: 北京中濟緯天專利代理有限公司11429
• 代理人: 許振強

1.一種抗腫瘤海鞘多肽CS5931凍干粉針制劑，其特征在于：所述制劑包括海鞘多肽CS5931和賦形劑。

2.根據權利要求1所述的抗腫瘤海鞘多肽CS5931凍干粉針制劑，其特征在于：所述賦形劑選自糖類、多元醇類、聚合物類中的一種或幾種；所述糖類選自葡萄糖、果糖、半乳糖、核糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、海藻糖、棉子糖、菊糖、纖維素中的一種或幾種，多元醇選自甘油、甘露醇、山梨醇、聚乙二醇、肌醇和硫醇中的一種或幾種，聚合物選自聚乙烯吡咯烷酮、牛血清白蛋白、右旋糖苷、聚乙二醇、明膠、β-環糊精、纖維素中的一種或幾種。

3.根據權利要求1所述的抗腫瘤海鞘多肽CS5931凍干粉針制劑，其特征在于：所述海鞘多肽CS5931與賦形劑的重量份數1：1～4，優選1：2。

4.一種如權利要求1中所述的抗腫瘤海鞘多肽CS5931凍干粉針制劑的制備方法，其特征在于：稱取海鞘多肽，加入適量注射用水溶解，加入賦形劑使溶解，補加注射用水至全量，用0.22μm濾膜無菌過濾，灌裝，將混合后的溶液裝入清潔無菌的西林瓶中，用膠塞半扣塞，冷凍干燥，即得。

5.根據權利要求1所述的抗腫瘤海鞘多肽CS5931凍干粉針制劑的制備方法，其特征在于：凍干過程是：預凍：板層溫度為-35℃～-25℃，保溫4-5小時；低溫升華干燥：真空度0～30Pa，板層溫度為-35℃～0℃，保溫15-17小時；二次干燥：板層溫度20～30℃，保溫4-5小時以上。

6.一種如權利要求1中所述的抗腫瘤海鞘多肽CS5931凍干粉針制劑的制備方法，其特征在于：凍干過程是：預凍：板層溫度為-35℃，保溫4小時；低溫升華干燥：真空度0～30Pa，板層溫度為-35℃～0℃，保溫16小時；二次干燥：板層溫度25℃，保溫4小時以上。

7.一種如權利要求1中所述的抗腫瘤海鞘多肽CS5931的制備方法，其特征在于：將克隆編碼多肽CS5931的基因在大腸桿菌中表達，并通過DEAE離子交換和Superdex75分子篩凝膠層析制備目的多肽；經變性復性后，制備好不帶His標簽的有活性的目的多肽；具體步驟如下：

1)海鞘多肽CS5931大腸桿菌表達體系發酵：克隆編碼多肽CS5931的基因連接入質粒PET-21a載體上，導入表達菌BL21構成工程菌BL21/pET21a-CS5931，簡稱pET21a-CS5931，將pET21a-CS5931接種在含有氨芐的培養基上進行活化，活化后的種子液轉接入含有氨芐的LB培養基中培養，接種后4-5h時加入IPTG進行誘導，繼續發酵培養4.5-8.5h；

所述的IPTG添加的終濃度為0.4mM-0.7mM；所述的活化后的種子液轉接入含有氨芐的LB培養基中的接種量在3-6％；所述的pET21a-CS5931活化后接種入LB培養基中發酵的裝液量在20-45％；所述IPTG加入后的發酵溫度為23℃-30℃；

2)海鞘多肽CS5931的分離純化：通過DEAE陰離子交換柱層析和Superdex75分子篩凝膠層析制備；使目的多肽得到純化；

3)所述的變性復性：向純化好的目的多肽溶液中分次緩慢加入8M尿素，1-3mML-半胱氨酸，0.3-0.6mML-精氨酸，0.3-0.6mMEDTA，反應3-5h；多肽樣品變性完成后，將變性樣品放于透析袋中，在復性液中透析24-30h，期間換1次復性液；復性完成后，將復性液更換為透析液，透析3-5h，將透析完成的樣品濃縮凍干得到純化后的抗腫瘤海鞘多肽CS5931。