[發明專利]一種大菱鲆增食欲素Orexin基因、重組蛋白及其制備方法

在審

• 申請號: 201611157216.4
• 申請日: 2016-12-15
• 公開（公告）號: CN106632645A
• 公開（公告）日: 2017-05-10
• 發明（設計）人: 劉濱;穆小生;黃濱;劉新富;遲慶宏;趙德輝
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院黃海水產研究所
• 主分類號: C07K14/46
• 分類號: C07K14/46;C12N15/12;C12N15/70
• 代理公司: 青島致嘉知識產權代理事務所(普通合伙)37236
• 代理人: 單虎

1.一種大菱鲆增食欲素Orexin，其特征在于：所述大菱鲆增食欲素Orexin的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.編碼權利要求1所述的大菱鲆增食欲素Orexin的Orexin基因，其特征在于：所述Orexin基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.根據權利要求2所述的Orexin基因，其特征在于：克隆所述Orexin基因所需的引物F1和R1序列如下：

F1: 5′- TGGGCAAGCGGGAGGAGGATGAGYAT -3′；

R1: 5′- ATRCTCATCCTCCTCCCGCTTGCCCA -3′。

4.含有權利要求2所述的Orexin基因的重組表達載體。

5.根據權利要求4所述的重組表達載體，其特征在于，所述重組表達載體為pET-24a-SL，其制備過程為：使用正向引物F和反向引物R，通過PCR擴增獲得所述Orexin基因，并在Orexin基因的兩端分別添加XhoI和EcoRI酶切位點，將該核苷酸序列經過限制性內切酶XhoI和EcoRI酶切后，插入pET-24a(+)表達載體XhoI和Eco4RI酶切位點之間，獲得重組表達載體pET-24a-orexin。

6.根據權利要求5所述的重組表達載體，其特征在于：所述正向引物F和反向引物R序列如下：

F:5′- CCGGAATTCATGACTCCCCTTCACAAAAAG-3′；

R:5′- CCGCTCGAGCACAGGAAGGGGTGTTGTGATG -3′；

PCR擴增的反應條件為：95℃5min；95℃35s，55℃退火35s，72℃延伸1min，35個循環。

7.權利要求1所述的大菱鲆增食欲素Orexin重組蛋白的制備方法，其特征在于：所述制備方法包括如下步驟：

（1）將重組表達載體pET-24a-orexin轉化大腸桿菌，將挑取的陽性克隆菌株接種于含有卡那霉素的LB液體培養瓶中，37℃振蕩培養過夜，次日轉接到含有LB 培養基的發酵罐中，37℃培養到OD600=0.5~1.0時，加入IPTG誘導重組蛋白表達，離心收集細菌培養物；

（2）將誘導表達后的細菌培養物重懸于裂解液中，超聲破碎，將超聲破碎的細胞裂解液離心，收集沉淀即為包涵體，使用包涵體洗滌液洗滌包涵體；用溶解緩沖液溶解包涵體，4℃放置過夜；室溫下離心；將上述溶液滴加到緩沖液，將稀釋后的包涵體溶液裝入透析袋中，4℃透析過夜；

（3）利用低壓層析系統，將透析后的包涵體溶液上樣至Ni柱；收集洗脫后的蛋白流出液；裝入透析袋中，放入緩沖液中，透析過夜；獲得純化后的增食欲素Orexin重組蛋白。

8.根據權利要求7所述的大菱鲆增食欲素Orexin重組蛋白的制備方法，其特征在于：所述步驟（1）中IPTG的濃度為0.5 ~ 0.7mmol/L，誘導表達的時間為3 ~5h。

9.根據權利要求7所述的大大菱鲆增食欲素Orexin重組蛋白的制備方法，其特征在于：所述步驟（3）中透析后的包涵體溶液以0.5 ml/min流速上樣至Ni-IDA -Sepharose CL-6B親和層析柱。