[發明專利]一種基于通用探針技術的熒光定量PCR方法

有效

• 申請號: 201611154624.4
• 申請日: 2016-12-14
• 公開（公告）號: CN108220399B
• 公開（公告）日: 2023-04-14
• 發明（設計）人: 李保偉
• 申請（專利權）人: 李保偉
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12Q1/06
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明涉及熒光定量PCR領域，提供了一種基于通用探針技術的熒光定量PCR方法，該方法既有Taqman探針特異性高的優點，又降低了開發成本，具有良好的推廣價值。兩種通用探針技術是本發明的核心部分，端通用探針技術的探針為雙標記探針，探針與上游組合特異引物的特定序列互補，中間特異引物起到類似Taqman探針特異性的作用，并引發探針的水解和信號釋放。中間通用探針技術的探針為3’端單標記熒光探針，探針與中間組合特異引物的特定序列互補，中間組合特異引物起到類似Taqman探針特異性的作用，同時該引物5’端標記有淬滅基團，當該引物在PCR反應中水解后，淬滅基團游離，探針的信號即可釋放。

技術領域

本發明涉及熒光定量PCR領域，特別是涉及熒光探針技術的優化，利用一個或少數幾個通用探針聯合中間特異引物，即可做到熒光定量PCR反應的特異性，并降低了實驗成本。

背景技術

熒光定量PCR是1996年由美國Applied?Biosystems公司推出的一種新的核酸定量實驗技術，它的原理是通過熒光染料或熒光標記的特異性的探針，對PCR產物進行標記跟蹤，實時監控反應過程，通過對產物量的實時分析，最終能夠對模板的初始濃度，核酸種類、基因突變類型等信息作出準確的判定。目前，熒光定量PCR在生物學研究及個體化醫學基因檢測領域有著廣泛的應用，其最特異的核酸標記方法為熒光探針標記法，即Taqman探針法，該標記方法特異性強，實驗結果穩定性好，不易產生假陽性，是熒光定量PCR用于醫學基因檢測的首選核酸標記方法。然而Taqman探針合成費用較高，當檢測多個位點或基因時，需要合成多條Taqman探針，將增加大量的實驗成本，這也是限制熒光定量PCR技術臨床推廣的主要原因。本專利就針對這一現象，設計了兩種類型的通用探針，分別結合于上游引物或中間特異引物上，所有熒光定量PCR實驗都可利用已有的通用探針進行，這將大大降低研發和生產成本，有利于熒光定量PCR在醫學基因檢測領域的應用。

發明內容

本發明提供了一種基于通用探針技術的熒光定量PCR方法，提出了兩種通用探針技術，分別是端通用探針技術和中間通用探針技術，以用于不同檢測目的的需要。

兩種通用探針技術是本發明的核心部分，它既包含了基于Taqman探針熒光定量PCR特異性高的優點，又彌補了其開發成本高、反應條件優化復雜等的缺陷。端通用探針技術所涉及的探針為雙標記探針，原理同于Taqman探針，只是把探針結合的序列轉移至上游組合特異引物上，同時設計一條中間特異引物，該引物起到類似Taqman探針特異性的作用，由這條特異引物引發端通用探針的水解，以實現熒光信號的釋放。中間通用探針技術所涉及的探針為3’端單標記熒光探針，探針結合的序列在中間組合特異引物上，中間組合特異引物具有與模板結合的特異序列，起到類似Taqman探針特異性的作用，同時該引物5’端標記有淬滅基團，當該引物在PCR反應中水解后，淬滅基團游離，與之結合的通用探針熒光信號即可釋放。

基于端通用探針的熒光定量PCR反應分為兩個階段，第一個階段為普通PCR反應，用到的引物為上游組合特異引物和下游特異引物，反應條件與一般PCR反應相同；第二階段為熒光定量PCR反應，模板是經核酸外切酶純化或瓊脂糖凝膠純化后的第一階段的PCR產物，引物有中間特異引物，上游通用引物和端通用探針，反應條件同于一般熒光定量PCR反應。

基于端通用探針的熒光定量PCR反應可以用于基因突變的檢測，在該應用中，上游組合特異引物的3’端的堿基可以按照ARMS-PCR引物的設計方法進行設計，這樣在第一階段的同一個反應體系中，可以混合同一位點兩種及兩種以上的基于ARMS方法設計的上游組合特異引物，也可以混合不同位點的兩種及兩種以上的基于ARMS方法設計的上游組合特異引物，不同位點的上游組合特異引物的通用探針反向互補序列也各不相同，以便在第二階段中利用反應管中特定的中間特異引物引發不同通用探針水解產生的熒光信號進行突變位點的鑒別，實現在一管中鑒別同一位點基因突變的基因型及突變比例，提高了ARMS-PCR方法的準確度和靈敏度。