[發明專利]表達綠色熒光蛋白的限制性復制西尼羅病毒系統及其應用

有效

• 申請號: 201611154016.3
• 申請日: 2016-12-14
• 公開（公告）號: CN106754982B
• 公開（公告）日: 2021-03-09
• 發明（設計）人: 華榮虹;步志高
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所
• 主分類號: C12N15/40
• 分類號: C12N15/40;C12N15/85;C12N5/10;C12N7/01;C07K14/435;G01N33/569
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司 11139
• 代理人: 孫皓晨;馬鑫

1.一種表達綠色熒光蛋白的限制性復制西尼羅病毒系統，其特征在于包括：

（1）西尼羅病毒限制性復制子質粒：

所述的西尼羅病毒限制性復制子質粒是通過將西尼羅病毒基因組克隆到真核表達載體pCI-neo的啟動子下游，并同時將基因組中的結構蛋白C-prM-E序列替換為綠色熒光蛋白基因后得到的；所述的西尼羅病毒限制性復制子質粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

（2）穩定表達西尼羅病毒 C-prM-E蛋白的重組細胞系

所述的穩定表達西尼羅病毒 C-prM-E蛋白的重組細胞系是通過以下方法構建得到的：

1）人工合成優化后的C-prM-E蛋白表達基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，優化后的序列命名為opti-WNV-CME，進行人工合成后通過PCR方法擴增優化后的序列，并在PCR產物的5′端引入 SacⅠ酶切位點，3′端引入 XhoⅠ酶切位點，雙酶切后的PCR 產物與同樣雙酶切的 pCAG-neo載體相連，連接產物轉化DH5α后，挑選重組克隆、經酶切和測序鑒定，獲得陽性克隆后用試劑盒大量制備質粒，命名為pCAG-WNV-CME，用SspI進行線性化后凍存于-20℃備用；

2）選生長狀態良好的BHK-21細胞消化傳代至 24 孔板中，待 BHK-21細胞長至 90%滿時，用線性化后的重組質粒pCAG-WNV-CME轉染細胞，獲得穩定表達的穩定表達西尼羅病毒C-prM-E蛋白的重組細胞系，命名為BWNV-CME。

2.權利要求1所述的系統在獲得表達綠色熒光蛋白的限制性復制西尼羅病毒中的用途。

3.一種獲得表達綠色熒光蛋白的限制性復制西尼羅病毒的方法，其特征在于包括以下步驟：

以含有 10%（v/v） FBS 的DMEM 培養基為生長培養基，1：4傳代培養權利要求1所述的穩定表達西尼羅病毒 C-prM-E蛋白的重組細胞系，將對數生長期的重組細胞以5 ×10⁵ /ml 接種 6孔細胞培養板，過夜培養，將權利要求1所述的西尼羅病毒限制性復制子質粒加入 Opti-MEM 中制成 DNA 稀釋液，每3 μg 質粒加入200 μl opti-MEM，加入 20 μl X-treme HP 轉染試劑，室溫靜置15min，將 DNA 轉染試劑復合物逐滴加入含有穩定表達西尼羅病毒 C-prM-E蛋白的重組細胞的培養液中，72 h 后觀察熒光，收取上清，離心過濾后儲存于 －80℃備用。

4.按照權利要求3所述的方法獲得的表達綠色熒光蛋白的限制性復制西尼羅病毒。

5.權利要求4所述的表達綠色熒光蛋白的限制性復制西尼羅病毒在制備西尼羅病毒中和抗體檢測試劑以及篩選抗西尼羅病毒藥物中的用途。