[發明專利]表達葡萄糖脫氫酶的工程菌及其構建方法與應用

有效

• 申請號: 201611153688.2
• 申請日: 2016-12-14
• 公開（公告）號: CN106754599B
• 公開（公告）日: 2018-10-26
• 發明（設計）人: 孫靜文;周衛;程明芳;李書田;王玉軍
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12N15/75;C12N9/04;C09K17/14;C09K101/00;C12R1/19;C12R1/11
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;任鳳華

本發明公開了表達葡萄糖脫氫酶的工程菌及其構建方法與應用。本發明所提供的表達葡萄糖脫氫酶的工程菌為具有溶磷活性的重組微生物。該具有溶磷活性的重組微生物通過賦予受體微生物葡萄糖脫氫酶活性來制備；所述具有溶磷活性的重組微生物的溶磷活性高于所述受體微生物。本發明通過賦予受體微生物(巨大芽孢桿菌WH320)葡萄糖脫氫酶CrGDH3A的活性構建具有溶磷活性的重組微生物，該重組微生物對磷酸三鈣的溶磷能力是受體微生物的11.59倍，對磷酸鋁的溶磷能力是其相應的受體微生物的16.23倍,對磷礦粉的溶磷能力是其相應的受體微生物的14.00倍。

技術領域

本發明涉及生物領域中表達葡萄糖脫氫酶的工程菌及其構建方法與應用。

背景技術

在農業生產上，增施磷肥是一種“高投入，低產出”的途徑。我國每年大約消耗2100萬～2200萬噸磷肥，但是磷肥當季作物利用率僅為5％-25％，90％左右的磷肥施入土壤后很快被化學固定，形成溶解性極低的磷酸鈣、鐵、鋁等化合物。磷是不可再生資源，隨著磷礦儲備的不斷消耗，我國可能面臨磷礦短缺而嚴重制約糧食生產。其實土壤中本不缺磷,但是它在土壤中的有效性非常低,多為難溶性的無機磷，植物很難吸收利用。因此，活化土壤中無效磷素，是農業生產急需解決的問題之一。

葡萄糖脫氫酶(glucose dehydrogenase，GDH)屬于短鏈乙醇脫氫酶家族的一員，在輔酶存在下，能夠催化D-葡萄糖轉化成D-葡萄糖酸-δ-內酯，而生成的D-葡萄糖酸-δ-內酯會進一步自發地水解成葡萄糖酸。研發具有高活性的葡萄糖脫氫酶進而構建葡萄糖脫氫酶溶磷工程菌，可以顯著提高溶磷細菌分解土壤無機磷的能力，在活化土壤無效磷素、提高磷肥利用率、減少磷肥投入方面具有重大價值。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是如何構建具有溶磷活性的微生物。

為了解決以上技術問題，本發明提供了具有溶磷活性的重組微生物。

本發明所提供的具有溶磷活性的重組微生物，是通過賦予受體微生物葡萄糖脫氫酶活性來制備；所述具有溶磷活性的重組微生物的溶磷活性高于所述受體微生物。

上述重組微生物中，所述賦予受體微生物葡萄糖脫氫酶活性通過將葡萄糖脫氫酶的編碼基因導入受體微生物中實現。

為了解決以上技術問題，本發明提供了構建具有溶磷活性重組微生物的方法。

本發明所提供的構建具有溶磷活性重組微生物的方法，包括將葡萄糖脫氫酶的編碼基因導入受體微生物，得到溶磷活性高于所述受體微生物的具有溶磷活性重組微生物；所述葡萄糖脫氫酶為a)或b)或c)或d)的蛋白質：

a)由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；

b)由SEQ ID No.6所示的氨基酸序列組成的蛋白質；

c)在a)或b)所示的蛋白質的羧基端或/和氨基端融合蛋白標簽得到的融合蛋白；

d)將SEQ ID No.2或SEQ ID No.6所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有葡萄糖脫氫酶活性的蛋白質。

本申請中，所述溶磷活性是指將無機磷轉化為可溶性磷的能力。其中，可溶性磷指能溶解到水中或溶解到弱酸中后可被植物吸收利用的磷。可溶性磷包括水溶性磷和/或可交換性磷。所述無機磷可為難溶的磷酸鹽(如磷酸三鈣或磷酸鋁)或磷礦粉。

上述方法中，a)所示的蛋白質的名稱為CrGDH3A；SEQ ID No.2由796個氨基酸殘基組成。

上述方法中，b)所示的蛋白質的名稱為CrGDH3A-His，SEQ ID No.2所示的CrGDH3A的N端連接MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHM得到的融合蛋白，SEQ ID No.6由817個氨基酸殘基組成。