[發明專利]一種采用兩次細胞培養工藝提高病毒液病毒含量的方法

有效

• 申請號: 201611153492.3
• 申請日: 2016-12-14
• 公開（公告）號: CN106754749B
• 公開（公告）日: 2019-12-10
• 發明（設計）人: 吳越;萬成燕;馮錫良;周俊花;曾衍華;陳樹林;黃梅
• 申請（專利權）人: 四川省華派生物制藥有限公司
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12R1/93
• 代理公司: 51229 成都正華專利代理事務所(普通合伙)
• 代理人: 李林合;李蕊

本發明公開了一種采用兩次細胞培養工藝提高病毒液病毒含量的方法，包括細胞培養：取生長良好的傳代細胞；傳代時細胞的接種密度為20萬~40萬個/ml，獲得接種細胞；制備種毒：取生長良好的傳代細胞加入生長液使傳代細胞長成單層后棄掉生長液接種基礎種毒，凍融后收獲得到生產用種毒；制備細胞懸液以及制備病毒液。本發明在現有常規的生產工藝上進行了優化，在單層細胞接種后再加入細胞懸液進行兩次細胞培養工藝，能夠打破現有生產工藝的瓶頸，有效提高病毒液中病毒的含量和滴度，有效縮短生產周期，提高產品質量，降低生產成本；同時本發明的方法還具有操作簡單和重復性好的特點。

技術領域

本發明涉及病毒培養技術領域，具體涉及到一種采用兩次細胞培養工藝提高病毒液病毒含量的方法。

背景技術

病毒(Virus)由一種核酸分子(DNA或RNA)與蛋白質(Protein)構成或僅由蛋白質構成(如朊病毒)。病毒個體微小，結構簡單。病毒沒有細胞結構，由于沒有實現新陳代謝所必需的基本系統，所以病毒自身不能復制。但是當它接觸到宿主細胞時，便脫去蛋白質外套，它的核酸(基因)侵入宿主細胞內，借助后者的復制系統，按照病毒基因的指令復制新的病毒。

豬偽狂犬病(Porcine Pseudorabies,PR)是由偽狂犬病病毒(Porcinepseudorabies virus,PRV)引起的以發熱和腦脊髓炎為主要特征的急性、發熱性傳染病。該病可引起豬、牛、羊、犬、貓、家兔、小白鼠、水貂、狐等多種家畜和野生動物發病，具有高致死率。而豬是該病毒增殖感染唯一可存活的宿主，是該病毒的自然儲存庫。所以，從豬群中切斷偽狂犬病毒的傳播是控制偽狂犬病的有效途徑。成年豬一般呈隱性感染，引起生長停滯，增重緩慢等；懷孕母豬可導致流產、死胎、木乃伊等綜合癥；7日齡以內的仔豬發病死亡率可達100％，斷奶仔豬發病率可達20％～40％。

目前，該病分布于全世界50多個國家和地區，我國已有23個省(市)報道了該病的發生，給畜牧業造成了巨大的損失。因此必須對該病進行有效的預防和控制，最根本的措施是疫苗接種，而疫苗效果好壞主要取決于抗原的制備，抗原的制備又大多采用細胞增殖病毒的方法，但由于該病毒在不同的細胞上增 殖效果不盡相同，出現病變的時間、病變特征、病變觀察的難易程度、病毒含量均有所差別，如不能掌握其規律選擇最佳的細胞系進行病毒的培養，將難以生產出優質的疫苗的。

轉瓶培養細胞是較傳統的一種生產工藝，該工藝按照常規的生產方法制備的半成品抗原效價較低，批間差會比較大，生產效率低下，難以達到配苗要求。常規方法的轉瓶生產，常在接毒時間、接毒量以及收獲時間上進行工藝摸索，找到病毒增殖的一個峰值；但是現有工藝基礎上對抗原病毒含量有進一步提升難度是非常大的。

發明內容

本發明的目的是提供一種采用兩次細胞培養工藝提高病毒液病毒含量的方法。

為達上述目的，本發明的一個實施例中提供了一種采用兩次細胞培養工藝提高病毒液病毒含量的方法，包括以下步驟：

(1)、細胞培養：取生長良好的傳代細胞，棄掉原培養液，使用PBS溶液沖洗；沖洗完畢后加入處理液進行消化傳代培養，傳代時細胞的接種密度為20萬～40萬個/ml，獲得接種細胞；

(2)、制備種毒：取生長良好的傳代細胞加入生長液使傳代細胞長成單層后棄掉生長液，接種基礎種毒，加入維持液并使基礎種毒均勻而充分的接觸單層細胞，待細胞病變達到70％～80％時將細胞在低溫下凍融，凍融后收獲得到生產用種毒；

(3)、制備細胞懸液：在接種細胞中加入處理液分散成單個細胞，然后加入含有血清的維持液振蕩待用，得到細胞懸液；

(4)、制備病毒液：取生長成單層的接種細胞加入生產用種毒，然后再加 入細胞懸液后培養，當細胞病變達到70％～80％時停止培養進行凍融處理，收獲病毒液。

優選的，述傳代細胞為ST細胞或者VERO細胞。