[發明專利]一種尿酸氧化酶的毛細管等電聚焦檢測方法

有效

• 申請號: 201611151762.7
• 申請日: 2016-12-14
• 公開（公告）號: CN108226263B
• 公開（公告）日: 2022-03-08
• 發明（設計）人: 楊麗華;袁杰;靳征
• 申請（專利權）人: 沈陽三生制藥有限責任公司
• 主分類號: G01N27/447
• 分類號: G01N27/447;G01N1/38
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明涉及一種檢測尿酸氧化酶的毛細管等電聚焦方法，具體包括將兩性載體、毛細管等電聚焦凝膠、尿素、陽極穩定劑、陰極穩定劑、等電點標記物和尿酸氧化酶樣品按照一定濃度比例進行混合，上樣于涂層毛細管，在合適溫度、電壓和聚焦時間下，通過毛細管電泳儀檢測，可使待分析的蛋白樣品中的各組分實現有效分離。該方法重復性好，可用于尿酸氧化酶類藥物在生產過程中的質量控制。

技術領域

本發明涉及一種毛細管等電聚焦檢測方法，用于測定尿酸氧化酶電荷異質性，該檢測方法可以對尿酸氧化酶類藥物進行良好的質控分析。

背景技術

尿酸是鳥類、爬行類和包括人在內的靈長類動物體內嘌呤代謝的終產物，因為在這些動物體內缺乏以分子氧為受體催化尿酸進一步分解為尿囊素、二氧化碳和雙氧水的尿酸氧化酶。尿酸作為人體嘌呤代謝的終產物經腎臟排泄，當尿酸生成超過腎臟代謝能力或者當腎臟處于病理狀態時就會都會造成血漿尿酸顯著升高，形成高尿酸血癥。由于尿素及其鹽類在血液中的低溶解度和易沉積性就使得高尿酸血癥會引發或加劇多種疾病，例如：持續高尿酸血癥時尿酸結晶沉積在外周關節、滑膜引起的急性炎癥和疼痛是痛風的主要病因；尿酸不僅可以刺激血管平滑肌細胞增殖，還將導致內皮細胞功能障礙；血漿高尿酸也是動脈粥樣硬化等心血管疾病的重要危險因素；尿酸沉積在腎臟組織，是引發急性腎衰、腎小管損傷、IgA腎炎的主要原因，因此高尿酸血癥會對自身健康帶來諸多風險。

降尿酸的經典方案是用別嘌呤醇等黃嘌呤氧化酶抑制劑類藥物降低尿酸生成，或用丙磺舒、苯溴馬龍等藥物促進尿酸排泄。黃嘌呤的水溶性低于尿酸，其積累有潛在的危險，黃嘌呤氧化酶抑制劑在初始尿酸濃度太高時療效很差，還能引發超敏綜合征，表現為發熱、毒性上皮細胞壞死溶解、肝炎和嗜酸細胞增高，死亡率達20％，另外這類藥和丙磺舒、苯溴馬龍等促尿酸排泄類藥都有明顯肝腎毒性。因此，經典的降尿酸治療策略不夠安全而且療效也不夠理想。尿囊素的優良水溶性和腎臟對尿囊素的高效排泄能力使尿酸氧化酶成為治療高尿酸血癥及其繼發癥的理想藥物：臨床研究表明尿酸氧化酶可快速高效降低血清尿酸，且幾乎沒有毒副作用；在治療腫瘤裂解綜合征時，尿酸氧化酶比別嘌呤醇更安全有效；用于治療痛風，能快速分解關節處沉積的尿酸從而消除引發的炎癥和皮膚損傷。

尿酸氧化酶作為一種新型的降尿酸藥物，其中一種重組黃曲霉尿酸氧化酶(商品名：拉布立酶)被歐美批準用于臨床預防治療腫瘤溶解綜合征，因此尿酸氧化酶具有良好的成藥性。當然作為蛋白類生物制品，良好的質量控制方法是其成藥的重要因素之一。本發明將提供一種對尿酸氧化酶具有良好和穩定質量控制的分析方法。

本發明采用的尿酸氧化酶是從產朊假絲酵母中提取基因組DNA，通過PCR擴增，設計特定的引物，從產朊假絲酵母基因組中分離尿酸氧化酶基因，并將其插入到大腸桿菌表達質粒中，得到重組產朊假絲酵母尿酸氧化酶轉化子，再將重組產朊假絲酵母尿酸氧化酶轉化子轉化入大腸桿菌中，得到可高效表達尿酸氧化酶的大腸桿菌工程菌株。再經過發酵培養，收獲表達重組重組產朊假絲酵母尿酸氧化酶的菌體，在經過菌體裂解、柱層析純化得到純化的重組產朊假絲酵母尿酸氧化酶(詳見發明專利ZL02819387.3)。不同種類的尿酸氧化酶對于尿酸的作用具有相同的作用方式和相似的理化性質，因此本發明的檢測方法同樣適用于其他尿酸氧化酶。

發明內容

本發明的目的在于提供一種新的基于毛細管電泳技術的尿酸氧化酶電荷異質性的分析方法，適用于尿酸氧化酶類藥物的質控分析。

本發明涉及的毛細管等電聚焦檢測方法包括以下步驟：

(1)將兩性載體、毛細管等電聚焦凝膠、尿素、陽極穩定劑、陰極穩定劑、等電點標記物和待分析的尿酸氧化酶樣品進行混合，形成混合液；

(2)將步驟(1)中的混合液上樣于涂層毛細管，在合適溫度、電壓和聚焦時間下，通過毛細管電泳儀檢測，得到等電聚焦譜圖；

(3)根據步驟(2)的等電聚焦圖譜中等電點標記物的遷移時間和pI值得到標準曲線，確定待分析的蛋白樣品各組分的pI值；