[發明專利]一種抗根腫病的甘藍?大白菜遠緣雜種的創制方法

在審

• 申請號: 201611149186.2
• 申請日: 2016-12-14
• 公開（公告）號: CN106613972A
• 公開（公告）日: 2017-05-10
• 發明（設計）人: 曾愛松;嚴繼勇;陳龍正;宋立曉;閆圓圓
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司32218
• 代理人: 傅婷婷,徐冬濤

技術領域

本發明屬于生物技術育種領域，涉及一種抗根腫病的甘藍-大白菜遠緣雜種的創制方法。

背景技術

根腫病是由根腫菌屬蕓薹根腫菌(Plasmodiophora brassicae Woron.)侵染引起的、危害十字花科作物的一種傳染性非常強的土壤病害，結球甘藍(Brassica oleracea L.Var.Capitata,，2n＝2x＝CC＝18，簡稱甘藍)是受其危害嚴重的寄主之一；目前生產上非常缺乏抗根腫病甘藍品種。甘藍對根腫病抗性屬于數量性狀遺傳，由多基因控制，易受環境影響；而且主要是隱性基因，這就使得利用常規育種方法改良甘藍根腫病抗性存在困難并且進展緩慢。國內外對大白菜抗根腫病的研究表明，大白菜對根腫病菌的侵染大多表現受顯性單基因控制。其中位于A3連鎖群的CRb基因對根腫菌生理小種2、4和8表現抗性，是一個優良的抗性基因。

發明內容

本發明的目的是針對目前甘藍資源遺傳基礎狹窄，抗根腫病資源缺乏這一現狀，提供一套利用胚胎拯救獲得甘藍-大白菜遠緣雜種的方法，創造一批抗根腫病的甘藍-大白菜遠緣雜種；同時為擴大甘藍基因庫，引進近緣種中優異的目標性狀(基因)，形成一套甘藍品種改良的方法。

為了實現本發明目的，本發明的一種抗根腫病的甘藍-大白菜遠緣雜種的創制方法，包括以下步驟：

(1)授粉方法：以抗根腫病大白菜為母本，甘藍為父本，配置雜交組合,采用人工剝蕾去雄重復授粉的方法，取父本新鮮花粉，涂抹在母本去雄的花蕾柱頭上；

(2)胚珠培養：取授粉后10d的子房消毒滅菌，剝取子房中的胚珠接種到胚挽救培養基上,在環境25±0.5℃，光照強度50-100μmol·m^–2·s^–1，光照時長12-14h·d^–1條件下培養25～30d，所述的胚挽救培養基為：MS+0.1mg/L NAA+0.2mg/L 6-BA+0.6g/L水解酪蛋白+7g/L瓊脂+25g/L蔗糖，pH為5.90～5.95；

(3)分化培養：待幼胚長至子葉形胚時，接入分化培養基誘導不定芽分化，所述的分化培養基為：MS+0.1mg/L NAA+1mg/L 6-BA+6g/L瓊脂+28g/L蔗糖，pH為5.90～5.95；

(4)繼代培養：20～30d后轉入繼代培養，繼代培養基為：MS+0.1mg/LNAA+0.2mg/L6-BA+7g/L瓊脂+25g/L蔗糖，pH為5.90～5.95；

(5)生根培養：繼代2周后接入生根培養基誘導生根，所述的生根培養基為：1/2MS+0.1mg/L NAA+0.1mg/L IBA+20g/L糖+7g/L瓊脂，pH為5.90～5.95；

(6)人工加倍：將修剪好的植株根部浸泡在配制的秋水仙素溶液中進行加倍，所述的處理條件為含2％二甲基亞砜濃度為0.4％的秋水仙素溶液中處理18-20h，處理完畢后，將根部的秋水仙素殘液沖洗干凈，最后定植于含有草炭土、珍珠巖和蛭石的穴盤中；

(7)形態學鑒定：對幼苗營養生長階段、生殖生長階段的主要形態特征進行觀察；

(8)細胞DNA相對含量測定：用流式細胞儀對后代加倍植株進行細胞DNA相對含量測定；

(9)根腫病抗性鑒定：通過菌土法接種鑒定和抗根腫病基因CRb的分子標記驗證相結合鑒定根腫病抗性，將基質滅菌后，每克滅菌土中接種0.001g病根，然后直接將鑒定材料播于菌土中，于25-28℃下培養，2個月后拔出幼苗，洗凈根部雜質，觀察發病情況；同時，利用與大白菜抗根腫病CRb基因緊密連鎖的SSR引物TCR13對后代植株進行分子標記鑒定，當后代材料的擴增譜帶中出現抗根腫病大白菜所具有的特異條帶時，即可判定其為攜帶CRb基因的真雜種。

其中，步驟(1)中所述的雜交組合的配置為：抗根腫病大白菜為母本，甘藍為父本。其中母本為引進的1份對根腫病表現免疫、攜帶CRb基因的大白菜材料。

步驟(2)中子房消毒滅菌方法為：用75％(體積分數)的乙醇消毒1min，然后用7％(體積分數)的次氯酸鈉滅菌15min，再用用無菌水沖洗3次，每次5min。

步驟(6)中秋水仙素溶液進行加倍處理時一定要沒過根部。

步驟(6)中草炭土、珍珠巖和蛭石的體積比為8:1:1。