[發明專利]一種雞產蛋下降綜合癥病毒雙抗體夾心ELISA檢測方法

在審

• 申請號: 201611146846.1
• 申請日: 2016-12-13
• 公開（公告）號: CN108614115A
• 公開（公告）日: 2018-10-02
• 發明（設計）人: 魏志剛;許賢會;梁桂霞
• 申請（專利權）人: 河南后羿實業集團有限公司
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569
• 代理公司: 鄭州中原專利事務所有限公司 41109
• 代理人: 張春;王曉麗

1.一種雞產蛋下降綜合癥病毒雙抗體夾心ELISA檢測方法，其特征在于：具體步驟如下：

（1）使用EDS₇₆作為抗原對產蛋雞和雄性健康成年兔進行免疫，制備雞抗EDS₇₆血清和兔抗EDS₇₆血清；

（2）提純雞抗EDS₇₆血清和兔抗EDS₇₆血清中的抗EDS₇₆免疫球蛋白，制得雞抗EDS₇₆免疫球蛋白和兔抗EDS₇₆免疫球蛋白；

（3）ELISA檢測步驟：

a. 將雞抗EDS₇₆免疫球蛋白用包被液稀釋，100 μL/孔，37 ℃下包被120 min；

b. 甩棄液體，洗滌液洗板3次，拍干，每孔加封閉液 100 μL封閉60 min；

c. 甩棄液體，洗滌液洗板3次，拍干，每孔加待檢樣品100 μL，37℃下作用60 min；

d. 甩棄液體，洗滌液洗板3次，拍干，每孔加稀釋好的兔抗EDS₇₆免疫球蛋白100 μL，37℃下作用60 min；

e. 甩棄液體，洗滌液洗板3次，拍干，每孔加稀釋好的HRP標記的羊抗兔的酶標抗體100μL，37℃作用90 min；

f. 甩棄液體，洗滌液洗板5次，拍干，每孔加TMB顯色液100 μL，37℃避光作用10 min；

g. 每孔加終止液100 μL，小心混勻，用酶標儀測OD₄₅₀值；

（4）臨界值的確定

用步驟（3）所述的ELISA檢測步驟測定30份陰性樣品的OD₄₅₀值，計算測得平均值X為0.280，標準差S=0.017，取X+3S=0.331作為判定的臨界值，當被檢樣品的OD₄₅₀值≥X+3S時，則判斷其為陽性，當被檢樣品的OD₄₅₀值＜X+3S時則是陰性。

2.根據權利要求1所述的雞產蛋下降綜合癥病毒雙抗體夾心ELISA檢測方法，其特征在于：所述步驟（3）的a步驟中，用包被液將雞抗EDS₇₆免疫球蛋白稀釋20-80倍。

3.根據權利要求1所述的雞產蛋下降綜合癥病毒雙抗體夾心ELISA檢測方法，其特征在于：所述步驟（3）的a步驟中，用包被液將雞抗EDS₇₆免疫球蛋白稀釋40倍，雞抗EDS₇₆免疫球蛋白的濃度為18 μg/mL。

4.根據權利要求1所述的雞產蛋下降綜合癥病毒雙抗體夾心ELISA檢測方法，其特征在于：所述步驟（3）的b步驟中，用抗體稀釋液將兔抗EDS₇₆免疫球蛋白稀釋80-200倍。

5.根據權利要求1所述的雞產蛋下降綜合癥病毒雙抗體夾心ELISA檢測方法，其特征在于：所述步驟（3）的b步驟中，用抗體稀釋液將兔抗EDS₇₆免疫球蛋白稀釋160倍，兔抗EDS₇₆免疫球蛋白的濃度為8 μg/mL。

6.根據權利要求1所述的雞產蛋下降綜合癥病毒雙抗體夾心ELISA檢測方法，其特征在于：所述步驟（3）的b步驟中的封閉液為質量百分比為1%的BSA-PBST。

7.根據權利要求1所述的雞產蛋下降綜合癥病毒雙抗體夾心ELISA檢測方法，其特征在于：所述步驟（3）的e步驟中，用抗體稀釋液將HRP標記的羊抗兔的酶標抗體稀釋4000-6000倍。

8.根據權利要求1所述的雞產蛋下降綜合癥病毒雙抗體夾心ELISA檢測方法，其特征在于：所述步驟（3）的e步驟中，用抗體稀釋液將HRP標記的羊抗兔的酶標抗體稀釋5000倍。