[發明專利]一種多環芳烴降解基因工程菌株、其構建方法及應用

有效

• 申請號: 201611146837.2
• 申請日: 2016-12-13
• 公開（公告）號: CN106754597B
• 公開（公告）日: 2019-05-10
• 發明（設計）人: 管運濤;劉梁
• 申請（專利權）人: 清華大學深圳研究生院
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/78;C12N15/66;B09C1/10;C12Q1/02;C12R1/40
• 代理公司: 深圳新創友知識產權代理有限公司 44223
• 代理人: 王震宇

一種多環芳烴降解基因工程菌株，該菌株Pseudomonas putida GLEB3已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏日期是2016年09月19日，保藏編號：CGMCCNo.13014，保藏地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所。本發明可有效提高基因工程菌株在生長過程中的可控性，降低應用其進行微生物強化修復過程中的生物安全風險。

技術領域

本發明涉及一種多環芳烴降解基因工程菌株、其構建方法及應用。

背景技術

在過去的十幾年內，應用基因工程菌(GEB)進行環境修復的研究進展比較緩慢。單從技術角度來講，研究學者們已經發現了大量的可以用于生物修復的遺傳系統，通過基因工程改造微生物的相關代謝系統可以大大提高其對污染物的降解效率，因此GEB往往都具有良好的特異性降解能力。而真正限制GEB應用于環境修復的因素往往是其未知與不可控的生態風險，這些菌株所攜帶的外源抗性基因一旦通過水平轉移進入其他生物體內，可能造成較為嚴重的抗性基因污染，同時GEB多為外來物種，其生長代謝是否會對土著微生物群落產生影響，均存在較大的不確定性。

為了解決上述問題，GEB在應用于環境修復前往往需要經過復雜而漫長的評估過程。如何將其改造得易監測、可控制是未來基因工程菌構建技術發展的趨勢。研究表明，向GEB中導入可調控的自毀系統(Active biological containment systems，ABC)可以實現對菌株的人為誘導衰亡，該方法主要是通過調控導入的自殺基因得以實現。具有ABC系統的細菌一旦遇到誘導物質，其攜帶的自殺基因則會通過破壞細胞膜、降解核酸物質等方式啟動自殺機制。雖然該系統功能的發揮會受到誘導物質接觸程度、細菌胞內蛋白表達量等多方面因素的影響，無法保證100％的致死率，但該系統對實現人為控制GEB在環境中的生長、防范其擴散仍具有極大地應用潛力。

發明內容

針對應用基因工程菌進行土壤修復過程中潛在的抗性基因污染及外源菌株擴散等生物安全風險，本發明提供一種具有誘導自毀機制的多環芳烴降解基因工程菌、其構建方法、應用以及自毀效率檢驗方法。

一種多環芳烴降解基因工程菌株，該菌株Pseudomonas putida GLEB3已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏日期是2016年09月19日，保藏編號：CGMCCNo.13014，保藏地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所。

進一步地：

所述構建方法包括以下步驟：

1)lac啟動子與核酸酶基因nuc的融合

以pAH12質粒為模板，采用引物nuc-f與nuc-r擴增核酸酶基因nuc。隨后采用Nde I和Hind III酶分別酶切擴增產物及pUC-18質粒，16℃連接過夜，構建pUC-nuc載體，轉化至E.coli DH5α感受態細胞后，篩選陽性克??；菌落PCR及酶切驗證后，提取質粒，采用引物lacnuc-f與lacnuc-r擴增連接有上游lac啟動子及操縱子的nuc基因，得到lacnuc融合基因；

2)重組轉座子載體pUT-lacnuc的構建

切膠回收后lacnuc融合基因的PCR產物并進行純化，采用Not I酶進行酶切，同時切割質粒pUT-mini Tn5(Km)；連接酶切產物，得到重組質粒pUT-lacnuc；

3)基因工程菌株Pseudomonas putida GLEB3的構建