[發明專利]一株高產L-異亮氨酸的基因工程菌及其構建方法和應用

有效

• 申請號: 201611146169.3
• 申請日: 2016-12-13
• 公開（公告）號: CN106701648B
• 公開（公告）日: 2019-09-20
• 發明（設計）人: 蘇海霞;邢盼盼;王炯;梅雪臣;宋盟軍;萬坤;劉愛福
• 申請（專利權）人: 武漢遠大弘元股份有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P13/06;C12R1/15
• 代理公司: 武漢開元知識產權代理有限公司 42104
• 代理人: 徐紹新

本發明公開了一株高產L?異亮氨酸的谷氨酸棒桿菌基因工程菌，該菌是將谷氨酸棒桿菌Corynebacterium glutamicum H5菌株敲除了編碼精氨基琥珀酸合成酶的argG基因及編碼氨基轉移酶的alaT基因，且在alaT基因被敲除的位點插入了編碼乙酰羥酸還原異構酶的ilvC基因的操縱子，所述谷氨酸棒桿菌Corynebacterium glutamicum H5保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO：M2016609。本發明還公開了該基因工程菌的構建方法及應用，本發明提供的基因工程菌用于發酵生產L?異亮氨酸，可提高產量和糖酸轉化率。

技術領域

本發明涉及一株高產L-異亮氨酸的基因工程菌，其構建方法及應用，屬于生物技術領域。

背景技術

L-異亮氨酸，又稱L-異白氨酸，化學名為L-α-氨基-β-甲基戊酸，屬于天冬氨酸族非極性、輸水性氨基酸的一種。L-異亮氨酸作為人體必需的8種氨基酸之一，是合成人體激素、酶類的原料，具有促進蛋白質合成和抑制分解的效果，成年人每天需要從外界攝取20mg/kg(體重)的L-異亮氨酸。因此，L-異亮氨酸在食品、醫藥、飼料和運動保健領域具有廣泛的應用及商業價值。

由于L-異亮氨酸具有2個不對稱碳原子，所以用化學合成方法生產比較困難，成本很高。生物轉化法制造L-異亮氨酸是將α氨基丁酸和α-氧代丁酸等作為前體原料進行生物合成，但由于原料昂貴，同樣存在生產成本過高的問題。因此，通過微生物發酵來生產L-異亮氨酸是一種必然的發展趨勢。

CN 105176907 A公布了一株通過重組大腸桿菌構建的L-異亮氨酸基因工程菌，通過大腸桿菌發酵生產L-異亮氨酸，最終產量為16.05±0.16g/L，糖酸轉化率達40.78％。

CN 104480057 A構建了alr基因缺陷的谷氨酸棒桿菌宿主菌，再將fusA、frr、ilvBN、ilvA、ppnk等基因連接到過表達載體，然后電轉入alr缺陷的宿主菌中，獲得一株谷氨酸棒桿菌基因工程菌，通過發酵產L-異亮氨酸，產量達到28.6g/L。

CN 105886431 A公布了一株誘變篩選得到的谷氨酸棒桿菌菌株，通過發酵產L-異亮氨酸，產量為28g/L。

CN 104212756 A公布了一株過表達fusA基因的谷氨酸棒桿菌基因工程菌，搖瓶發酵產L-異亮氨酸為8.7g/L。

發明內容

本發明的目的是提供一株高產L-異亮氨酸的基因工程菌及其構建和應用。本發明根據篩選得到的谷氨酸棒桿菌突變菌株Corynebacterium glutamicum H5的代謝特點，利用基因工程技術來改造其基因組，通過敲除或者插入相關基因，減弱代謝支路的雜酸如丙氨酸、纈氨酸等的合成；增加L-異亮氨酸的前體如天冬氨酸及蘇氨酸的合成，促進碳通量更多流向L-異亮氨酸合成途徑，使其在發酵過程中能大幅提高產L-異亮氨酸的能力，從而降低生產成本，具有廣闊的工業應用前景。

為了實現上述目的，本發明采用以下技術方案：

一株高產L-異亮氨酸的基因工程菌，命名為C.glutamicum H5ΔargGΔalaT：：ilvC，其分類為谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)，該基因工程菌是將谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)H5菌株敲除了編碼精氨基琥珀酸合成酶的argG基因及編碼氨基轉移酶的alaT基因，且在alaT基因被敲除的位點插入了編碼乙酰羥酸還原異構酶的ilvC基因的操縱子。

其構建方法包括以下步驟：

(1)出發菌株是本實驗室篩選得到的突變菌株，命名為Corynebacteriumglutamicum H5，其分類為谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)，屬于革蘭氏陽性菌。