[發明專利]對4種曲霉菌同步定量和基因分型的二聚體突變熒光引物定量PCR方法

有效

• 申請號: 201611145658.7
• 申請日: 2016-12-13
• 公開（公告）號: CN106755379B
• 公開（公告）日: 2021-06-04
• 發明（設計）人: 夏乾峰;董素芳
• 申請（專利權）人: 海南醫學院
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12Q1/6895;C12Q1/06;C12R1/66;C12R1/685;C12R1/67
• 代理公司: 武漢科皓知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 張火春

發明屬于生物檢測領域，提供一種基于二聚體突變引物建立的熒光定量PCR方法定量檢測4中曲霉菌并同步進行基因分型的方法，該檢測方法包括1）提取待檢測樣品及4種標準菌株中的DNA；2）制備陽性質粒標準品；3）運行熒光定量PCR；4）數據分析。本發明還提供一種煙曲霉菌、黑曲霉菌、黃曲霉菌和土曲霉菌同步定量和基因分型的檢測試劑盒，該試劑盒包括標記有熒光報告基團的上游引物、淬滅基團標記的上游引物互補鏈及下游引物，它們的核苷酸序列如SEQ ID No.1?3所示。是一種高通用性、高特異性和靈敏性、操作簡單、價廉的新型real?time PCR技術，具有臨床應用價值，可望產生良好的社會效益和經濟效益。

技術領域

本發明屬于生物檢測領域，具體地說，是一種基于二聚體突變引物建立的熒光定量PCR方法定量檢測曲霉菌并同步進行基因分型的方法。

背景技術

曲霉菌包括132個種和18個變種，占空氣中真菌的12％左右，是通過空氣傳播的常見霉菌，早在1848年就被視為感染根源，不僅會影響人和動物的健康，，還會給農業生產帶來巨大的損失。

近年來，隨著在器官、骨髓和造血干細胞移植，HIV，腫瘤放化療等所導致的免疫力低下患者增多，條件致病菌——曲霉菌引起的侵襲性真菌感染逐年升高，臨床上最常見的是煙曲霉(A.fumigatus)，黃曲霉(A.flavus)，土曲霉，黑曲霉(A.niger)，雜色曲霉(A.versicolor)，等，其中黃曲霉的致病率占90％。

雖然已有大量的抗真菌藥物上市，但缺乏早期的快速準確的檢測曲霉菌的實驗室方法，致使臨床曲霉病的病死率居高不下(30％)，若未及時治療，病死率可達90％以上。而臨床上對曲霉菌病的治療費用昂貴，許多患者會放棄治療。故一種早期快速準確的診斷曲霉菌的實驗室診斷方法，可以有效降低曲霉病病死率和醫療負擔。

傳統的曲霉菌檢測方法有培養法、影像學檢查、組織病理學檢查等方法，如大部分實驗室需要根據真菌的菌落表現特征以及顯微鏡下特征性的分子孢子頭和足細胞來鑒定，過程需要7～14天。傳統的檢測方法存在檢測時間長，陽性率低等缺陷。另外也有一些非傳統的檢測方法，如乳膠凝集法、半乳甘露聚糖法等，乳膠凝集法存在檢測敏感度低及假陽性率高等問題；眾多學者對半乳甘露聚糖法的特異性和靈敏性高低存在爭論。隨著技術的發展，PCR方法進入到臨床檢測領域，特別是實時熒光定量PCR(real-time polymerase chainreaction，real-time PCR)技術的應用，不僅可以早期準確檢測，還可以進行定量和分型檢測。

Real-time PCR分為內摻式染料技術和探針技術兩類。內摻式染料技術采用的染料一般為溴化乙啶、YO-PRO 1和SYBR Green。其原理是利用游離DNA染料不發射熒光，而與雙鏈DNA結合后，熒光值大大增強，從而進行DNA定量。并且還可通過熒光信號監測產物解鏈溫度差異，進行熔解曲線分析，根據不同DNA產物會產生不同的熔解曲線，而實現基因分型。其優勢在于能夠監測任何雙鏈DNA，只需設計普通引物，使檢測方法簡化，成本低。但也正是由于染料能夠與任何雙鏈DNA結合，因此其也能和非特異性產物如引物二聚體、非特異擴增產物、雙鏈模板等結合，產生非特異熒光信號，降低了特異性，故不適于臨床檢測。