[發(fā)明專利]超聲?熒光檢測多毛類體內(nèi)石油烴含量的方法

在審

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• 申請日: 2016-12-13
• 公開（公告）號: CN106814050A
• 公開（公告）日: 2017-06-09
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 周一兵;趙歡;楊大佐;趙新達;樊鑫;矯志偉
• 申請（專利權(quán)）人: 大連海洋大學(xué)
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;G01N1/40
• 代理公司: 大連非凡專利事務(wù)所21220
• 代理人: 曲寶威

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于海洋環(huán)境污染監(jiān)測技術(shù)，主要涉及一種測定海洋無脊椎多毛類石油烴含量的方法。

背景技術(shù)

石油烴化合物是造成海洋污染的主要物質(zhì)之一，海洋中的石油烴類富集在海洋生物體內(nèi)，可以通過食物鏈傳遞進而對人體造成危害。多毛類隸屬于環(huán)節(jié)動物門，是廣泛分布于海洋近岸和河口潮灘的優(yōu)勢底棲動物，由于其具有體型大、生命周期長、行動緩慢等特點，極易接觸并富集沉積質(zhì)中的石油烴化合物在體內(nèi)。研究表明，海洋多毛類能夠攝入大量的沉積物，通過一系列的轉(zhuǎn)化和分解作用使之成為無毒的代謝產(chǎn)物排出體外，表現(xiàn)出對許多持久性污染物較強的耐受性和生物利用性，因此目前已作為海洋沉積環(huán)境污染評價的指示生物和毒理研究的模型動物。故測定其體內(nèi)石油烴的含量可以深入了解石油烴化合物在其體內(nèi)的轉(zhuǎn)化和分解，為海洋環(huán)境污染監(jiān)測和海洋風(fēng)險評估提供新的技術(shù)支持。

目前測定海洋生物體內(nèi)石油烴的含量應(yīng)用皂化方法處理樣品，但是皂化效果的差異會導(dǎo)致樣品石油烴含量測定產(chǎn)生巨大的差異性。如果皂化效果不好，萃取液會出現(xiàn)較嚴(yán)重的棕黃色，使得乳化現(xiàn)象嚴(yán)重，影響萃取的效果，從而影響測定結(jié)果。此外皂化過程較為復(fù)雜耗時，皂化萃取過程中， 試劑加入的順序、加入水的質(zhì)量和數(shù)量、取樣量多少、皂化時間、溫度、萃取次數(shù)均會影響最終測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。許巖等人（2014）研究了熒光分光光度計法測定貝類產(chǎn)品石油烴含量過程中所產(chǎn)生的不確定度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)貝類產(chǎn)品石油烴測定的不確定度主要由樣品的皂化反應(yīng)處理過程中的損失所致。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種能夠高效便捷、測試結(jié)果準(zhǔn)確的超聲-熒光檢測多毛類體內(nèi)石油烴含量的方法，克服現(xiàn)有技術(shù)的不足。

本發(fā)明的超聲-熒光檢測多毛類體內(nèi)石油烴含量的方法，是利用超聲萃取提取多毛類體內(nèi)石油烴，進而利用熒光檢測來測定多毛類體內(nèi)石油烴含量，所述方法包括以下步驟：

a、油標(biāo)準(zhǔn)液的配置：稱取0.1g標(biāo)準(zhǔn)油于稱量瓶中，用色譜純正己烷溶解，全量移入100mL容量瓶中，用色譜純正己烷稀釋至標(biāo)線，混勻；

將100mL容量瓶中混勻的溶液移取5mL溶液于50mL容量瓶中，用正己烷稀釋至標(biāo)線，混勻，配置成100ug/mL的油標(biāo)準(zhǔn)使用溶液；

分別量取0mL、0.1mL、0.3mL、0.5mL、0.7mL、0.9mL油標(biāo)準(zhǔn)使用溶液于6只10mL具塞比色管中，用色譜純正己烷稀釋至標(biāo)線混勻；

依次用1cm石英測定池，以正己烷作參比，測定360nm處的熒光強度Ii和I0，并記錄測定數(shù)據(jù)，以熒光強度Ii—I0作為縱坐標(biāo)，相應(yīng)以濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；

b、在105℃條件下將多毛類烘干成粉末，烘干時間16小時；

c、將粉末狀多毛類樣品與色譜純二氯甲烷混合進行超聲萃取，每0.05g粉末狀多毛類樣品加入1ml色譜純二氯甲烷，每次超聲時間為10min，間隔3min，重復(fù)此操作4次，4000 r/min 離心10分鐘，收集上清液；

d、將c步驟中收集的上清液加入預(yù)先用色譜純二氯甲烷平衡8~12小時的60~100目硅膠層析柱，利用20ml二氯甲烷進行洗脫；

e、將d步驟獲得的洗脫液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行蒸發(fā)處理，用正己烷定容至10ml后，用孔徑0.22um的尼龍膜過濾后，于激發(fā)波長310nm，發(fā)射波長360nm，狹縫設(shè)置1nm，掃描速度1200nm/min，PMT 700V的條件下進行熒光分光光度測定；

f、以e步驟所測數(shù)據(jù)從a步驟的標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出相應(yīng)數(shù)值，按照公式W=(m·V)/(F·M) 計算出多毛類樣品中石油烴含量；其中m代表從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得石油烴的含量，單位為微克每毫升，V為萃取劑的體積，單位為毫升，F代表樣品的干濕比；M代表樣品的稱取量，單位為克；

所述的多毛類為雙齒圍沙蠶或日本此沙蠶或多齒圍沙蠶；所述的樣品油為石油原油標(biāo)準(zhǔn)油20-3#。

本發(fā)明首次利用超聲-熒光檢測方法測定了海洋多毛類動物體內(nèi)石油烴的含量，通過正交實驗和數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，在用二氯甲烷作為溶劑和洗脫劑，超聲10分鐘重復(fù)4次條件下，加標(biāo)回收率范圍在89.3%-94.6%，能夠高效并準(zhǔn)確測定海洋多毛類動物體內(nèi)石油烴的含量，這一方法為深入了解石油烴化合物在海洋多毛類動物體內(nèi)的轉(zhuǎn)化和分解提供技術(shù)支持，亦為海洋環(huán)境污染監(jiān)測和海洋風(fēng)險評估奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明的方法高效便捷、測試結(jié)果準(zhǔn)確。

附圖說明

圖1為實施例石油烴檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線。

具體實施方式