[發(fā)明專利]一種利用駝峰藤幼嫩莖段及葉片快速繁殖無菌苗的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201611144933.3
• 申請日: 2016-12-13
• 公開（公告）號: CN106577280B
• 公開（公告）日: 2018-12-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 侯俊;王彩云
• 申請（專利權(quán)）人: 侯俊
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 遵義市遵科專利事務(wù)所 52102
• 代理人: 劉學(xué)詩

1.一種利用駝峰藤幼嫩莖段及葉片快速繁殖無菌苗的方法，其特征在于如下步驟：

1）外植體培育：將駝峰藤種子經(jīng)浸泡催芽處理后，播種于以椰糠：沙子=1:1為基質(zhì)的苗床，小苗長至5.0 cm左右后移栽到大田，需要外植體材料時(shí)，用不銹鋼剪刀剪取頂端新長出的莖段或葉片，作為外植體材料來源；

2）外植體的獲取及消毒：于晴天剪取長勢良好的駝峰藤嫩莖和葉片，裝入潔凈塑料袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室，將莖剪成長3.0～4.0 cm的莖段即僅取莖尖頂端前4節(jié)、嫩葉剪成大小合適的方形組織塊，置于潔凈的燒杯中，用流水沖洗10～15 min，然后將莖段和葉片在洗潔精水中浸泡15 min左右，再用流水沖洗干凈，沖洗后的莖段于超凈工作臺(tái)上，先用75%酒精浸泡20 s，用無菌水漂洗3次，后用0.1%升汞浸泡10 min，無菌水漂洗4次，每次1.5 min， 沖洗后的葉片于超凈工作臺(tái)上，先用75%酒精浸泡10 s，然后用無菌水漂洗2次，再于0.1%升汞中浸泡8 min，然后用無菌水漂洗4次，每次1.5 min，然后將消毒后的嫩莖和葉片放入事先準(zhǔn)備好的無菌培養(yǎng)皿中，用無菌濾紙吸干材料上殘留的水分，接種前將莖用無菌不銹鋼刀片切成2.5～3.0 cm長的帶腋芽莖段，以腋芽著生點(diǎn)為基準(zhǔn)，上端長約1.0 cm，下端長1.5～2.0cm，下端切成楔形；將消毒后的葉片切割成1.0 cm²左右，然后將切好的外植體接種到過渡培養(yǎng)基中，培養(yǎng)15~20 d后挑取無污染的外植體誘導(dǎo)愈傷組織或不定芽；

3）葉片愈傷組織誘導(dǎo)：將過渡培養(yǎng)基中無污染的葉片外植體轉(zhuǎn)接到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，接種時(shí)外植體橫放，并輕壓外植體材料使之與培養(yǎng)基充分接觸；培養(yǎng)室溫度24～26℃，濕度70～80%，光照強(qiáng)度1800～2000 lx，每天光照時(shí)間10～12 h，一周后可見米白色或鮮綠色愈傷組織從切口處長出，待愈傷組織長到1.5 cm左右寬時(shí)，轉(zhuǎn)入愈傷組織增殖培養(yǎng)基中誘導(dǎo)增殖；

4）葉片愈傷組織增殖：將疏松、嫩綠色、長勢良好的愈傷組織轉(zhuǎn)接入愈傷組織增殖培養(yǎng)基上，用鑷子輕壓愈傷組織使之與培養(yǎng)基充分接觸，培養(yǎng)室溫度24～26 ℃，濕度70～80%，光照強(qiáng)度1800～2000 lx，每天光照時(shí)間10～12 h，培養(yǎng)30 d后，可見愈傷組織大量長出；

5）不定芽誘導(dǎo)：將過渡培養(yǎng)基中無污染的莖段外植體轉(zhuǎn)接到不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，接種時(shí)將莖段豎直插入培養(yǎng)基中達(dá)0.5～1.0 cm，使之與培養(yǎng)基充分接觸；將愈傷組織接種到不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)不定芽，接種時(shí)輕壓愈傷組織，使之與培養(yǎng)基充分接觸，培養(yǎng)室溫度24～26℃，濕度70～80%，光照強(qiáng)度1800～2000 lx，每天光照時(shí)間10～12 h，15 d后產(chǎn)生兩種不定芽，一種是長度大于1.0 cm的單芽，另一種是帶有愈傷組織，長度小于1.0 cm的叢生芽，待不定芽長到1.5 cm左右高時(shí)，即可轉(zhuǎn)入不定芽增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)；

6）不定芽增殖：將單芽苗切成1.5 cm左右長的小段，接種于不定芽增殖培養(yǎng)基中誘導(dǎo)增殖；將簇生態(tài)的叢生芽切成1.0 cm²左右，接種于不定芽增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，接種時(shí)將莖段豎直插入培養(yǎng)基中達(dá)0.5～1.0 cm，使之與培養(yǎng)基充分接觸；培養(yǎng)室溫度24～26℃，濕度70～80%，光照強(qiáng)度1800～2000 lx，每天光照時(shí)間10～12 h，培養(yǎng)15 d后，可見不定芽大量長出；

7）生根培養(yǎng)：選取高3.0~5.0 cm的不定芽，接種于生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)30 d，即可得駝峰藤無菌苗；培養(yǎng)室溫度24～26 ℃，濕度70～80%，光照強(qiáng)度1800～2000 lx，每天光照時(shí)間10～12 h；所述的以下步驟中：

步驟2）中培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基，添加7 g/L卡拉膠、20 g/L的蔗糖，

步驟3）中愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，添加0.05 mg/L~0.10 mg/L的NAA、1.0~3.0 mg/L的6-BA、0.10~0.20 mg/L的KT、30 g/L的蔗糖、7 g/L的卡拉膠，

步驟4）中愈傷組織增殖培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，添加0.10 mg/L的NAA、1.0～2.5mg/L的6-BA、30 g/L的蔗糖、7 g/L卡拉膠，

步驟5）中不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，添加0.05 mg/L~0.15 mg/L的NAA、1.0~3.0 mg/L的6-BA、0.05~0.10 mg/L的GA₃、30 g/L的蔗糖、7 g/L的卡拉膠，

步驟6）中不定芽增殖培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，添加0.15 mg/L的NAA、1.5～3.5 mg/L的6-BA、30 g/L的蔗糖、7g/L卡拉膠，

步驟7）中生根培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，添加0.1~0.5 mg/L的NAA、20 g/L的蔗糖、7g/L卡拉膠。