[發明專利]雷公藤TwKS與TwCPS3在制備貝殼杉烷型二萜化合物中的應用

有效

• 申請號: 201611142902.4
• 申請日: 2016-12-12
• 公開（公告）號: CN107058419B
• 公開（公告）日: 2018-04-13
• 發明（設計）人: 高偉;黃璐琦;蘇平;周家偉
• 申請（專利權）人: 首都醫科大學
• 主分類號: C12P17/18
• 分類號: C12P17/18;C12N15/81
• 代理公司: 北京鼎承知識產權代理有限公司11551
• 代理人: 張波濤,管瑩

技術領域

本發明通過構建TwCPS3和TwKS真核及原核表達載體，通過體外酶促和酵母發酵的方法成功合成了16α-貝殼杉烷，其與赤霉素的生物合成相關。涉及雷公藤生長發育調控和活性成分的合成，屬于藥用植物基因工程領域。

背景技術

藥用植物雷公藤(Tripterygium wilfordii.Hook.f.)是一味中草藥，被廣泛用于類風濕性關節炎和炎癥的治療。萜類成分為雷公藤的主要活性成分，包括雷公藤甲素(triptolide)、雷酚內酯(triptophenolide)和雷公藤紅素(celastrol)等。現有研究表明貝殼杉烷型二萜是萜類天然產物家族中的主要組成部分，這類分子通常表現出抗菌、抗腫瘤、抗瘧、抗病毒等多種重要生物活性。從中藥活性成分開發新藥是一種很有潛力的方式，然而由于植物的生長緩慢，再加上這些有效成分在植物體中的含量不多，因而大大限制了它的發展。通過探尋和闡釋萜類成分，特別是探尋貝殼杉烷型二萜在雷公藤中的生物合成途徑及其調控機制，能夠為利用生物技術提高目標成分含量或直接生產有效成分或中間體帶來廣闊的應用空間。

赤霉素是一種四環雙萜化合物，在植物的生長調節方面具有非常重要作用的物質。現有研究表明赤霉素在植物的種子萌發，莖的生長，開花和結果具有重要的調節作用。貝殼杉烷型二萜是一類雙萜化合物，其具體種類和含量對于下游赤霉素的生物合成具有重要影響。從貝殼杉烷型二萜化合物前體到赤霉素生物合成途徑的解析有助于調控雷公藤中雷公藤甲素、雷公藤紅素等活性成分的生物合成。

發明內容

本發明通過對雷公藤柯巴基焦磷酸合酶基因Twcps3和雷公藤貝殼杉烯合酶基因Twks進行表達載體的構建，成功合成了赤霉素的前體物16α-貝殼杉烷，這對雷公藤甲素等活性成分的生物合成調控具有重要的意義。

具體而言本發明將克隆得到的Twcps3和Twks基因的cDNA克隆到原核表達載體pMAL-c2X，構建帶有Twcps3和Twks基因的重組表達載體；轉入E.coli表達宿主菌，通過誘導后，表達產物經初步純化后，加入到以GGPP為底物的體外酶促反應體系中，正己烷萃取反應產物，采用GC-MS檢測到貝殼杉烷型二萜化合物的生成，經過對GC-MS圖譜的分析結果表明，TwCPS3和TwKS聯合使用能夠將GGPP轉化為貝殼杉烷型二萜類化合物，出乎意料的是，所述貝殼杉烷型二萜類化合物中除了目前已知的赤霉素前體對映貝殼杉烯以外，還能夠產生ent-16α貝殼杉烷，另外產物中還發現一定量的淚杉醇。

通過將Twcps3和Twks基因的ORF克隆到真核表達載體pESC-Trp，構建帶有Twcps3和/或Twks基因的重組表達載體并通過定點突變等方法，通過酵母BY-T20發酵生成產物，利用氣相色譜-質譜聯用技術，分析Twcps3和Twks基因的功能。研究結果表明，真核表達的TwCPS3和TwKS能夠將GGPP轉化為貝殼杉烷型二萜，并且ent-16α貝殼杉烷的產量更高。本發明對雷公藤的生長發育以及活性成分的生物合成調控具有重要意義。

本發明提供一種雷公藤柯巴基焦磷酸合酶TwCPS3和雷公藤貝殼杉烯合酶TwKS在制備貝殼杉烷型二萜中的應用，其特征在于以牻牛兒基焦磷酸GGPP為底物，催化產生貝殼杉烷型二萜化合物。

其中，所述的雷公藤柯巴基焦磷酸合酶TwCPS3的序列為SEQ ID NO：1，雷公藤貝殼杉烯合酶TwKS的序列為SEQ ID NO：3。

本發明還提供雷公藤柯巴基焦磷酸合酶基因Twcps3和雷公藤貝殼杉烯合酶基因Twks在制備貝殼杉烷型二萜中的應用，其特征在于重組表達Twcps3和Twks基因獲得TwCPS3和TwKS用于制備貝殼杉烷型二萜，其中雷公藤柯巴基焦磷酸合酶基因Twcps3的序列為SEQ ID NO：2，雷公藤貝殼杉烯合酶基因Twks的序列為SEQ ID NO：4。

本發明所述雷公藤柯巴基焦磷酸合酶基因Twcps3和雷公藤貝殼杉烯合酶基因Twks在制備貝殼杉烷型二萜中的應用其中所述Twcps3和Twks基因通過原核表達或真核表達獲得TwCPS3和TwKS，優選將所述基因進行真核表達。

本發明所述雷公藤柯巴基焦磷酸合酶基因Twcps3和雷公藤貝殼杉烯合酶基因Twks在制備貝殼杉烷型二萜中的應用，利用原核表達載體pMAL-c2X分別構建帶有Twcps3或Twks基因的重組原核表達載體；利用真核表達載體pESC-Trp分別構建帶有Twcps3或Twks基因的重組表達載體。