[發(fā)明專利]基因飽和突變庫(kù)及其構(gòu)建方法、應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201611139117.3
• 申請(qǐng)日: 2016-12-12
• 公開（公告）號(hào): CN106754875B
• 公開（公告）日: 2020-02-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馮淼;田會(huì)娟;王璐;王麗娜;田敬東
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所
• 主分類號(hào): C12N15/10
• 分類號(hào): C12N15/10;C40B50/06;C40B40/08
• 代理公司: 11227 北京集佳知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 趙青朵

1.一種基因飽和突變庫(kù)的構(gòu)建方法，其特征在于，以含有表達(dá)目的蛋白的基因的環(huán)狀雙螺旋DNA質(zhì)粒為模板，采用一對(duì)序列完全反向互補(bǔ)的正向突變引物和反向突變引物，通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)構(gòu)建獲得基因飽和突變庫(kù)；

所述正向突變引物和所述反向突變引物的序列中分別含有9個(gè)以上連續(xù)排列的兼并堿基；

所述含有表達(dá)目的蛋白的基因的環(huán)狀雙螺旋質(zhì)粒的長(zhǎng)度不小于8 kb；

所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的循環(huán)數(shù)不高于18；

所述正向突變引物和所述反向突變引物的序列如SEQ ID No.7~ SEQ ID No.112所示；

所述基因包括序列如SEQ ID No.6所示的PR基因、視黃醛合成相關(guān)的5個(gè)基因——序列如SEQ ID No.1所示的crtE、序列如SEQ ID No.2所示的crtB、序列如SEQ ID No.3所示的crtI、序列如SEQ ID No.4所示的crtY及序列如SEQ ID No.5所示的β-diox；

所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的體系為：所述環(huán)狀雙螺旋DNA質(zhì)粒20~100 ng、所述正向突變引物100~200 nM、所述反向突變引物100~200 nM、Q5高保真聚合酶1U、1×Q5反應(yīng)緩沖液；

所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的條件為：98℃預(yù)變性1~2.5 min、以如下條件進(jìn)行10~18個(gè)循環(huán)：98℃ 0.5~1 min、退火0.5~2 min、72℃延伸15 s/kb，最后以72℃再進(jìn)行2~5 min延伸。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，獲得所述基因飽和突變庫(kù)后還包括經(jīng)DpnI酶消化除去模板后，直接轉(zhuǎn)化到宿主菌進(jìn)行培養(yǎng)基平板篩選的步驟。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述正向突變引物由三部分序列組成：5’-模板序列、兼并堿基序列和3’-模板序列，其中所述兼并堿基序列是以兼并堿基代替了目的基因中待突變的序列，5’-模板序列是目的基因中待突變序列5’端上游的序列，3’-模板序列是目的基因中待突變序列3’端下游的序列；

所述反向突變引物的序列為所述正向突變引物的反向互補(bǔ)序列。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述5’-模板序列和所述3’-模板序列的T_m值相差不高于5℃，所述5’-模板序列和所述3’-模板序列的長(zhǎng)度均不低于所述兼并堿基序列。

5.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的構(gòu)建方法獲得的基因飽和突變庫(kù)。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的基因飽和突變庫(kù)在蛋白質(zhì)功能位點(diǎn)的快速篩選定位和/或高效突變改造中的應(yīng)用。