[發明專利]基于聚苯乙烯-二乙烯苯樹脂為載體的真菌毒素免疫親和柱的制備方法

在審

• 申請號: 201611138059.2
• 申請日: 2016-12-12
• 公開（公告）號: CN108614054A
• 公開（公告）日: 2018-10-02
• 發明（設計）人: 丁軻;張家寧;韓濤
• 申請（專利權）人: 北京農學院
• 主分類號: G01N30/06
• 分類號: G01N30/06;G01N30/56
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

基于聚苯乙烯?二乙烯苯樹脂為載體的真菌毒素免疫親和柱的制備方法，屬于制備技術，它包括抗體的制備和純化、基質材料制備、配體偶聯、裝柱。本發明設計新穎，工藝先進，方法獨特，用途廣。不但解決了真菌毒素在傳統富集過程中存在的基質干擾、特異性低、成本高等問題，并且實現多目標同時凈化，特異性強，機械強度高，pH適用范圍廣，極大地提高了免疫親和柱的使用效率，同時易操作，生產成本低，且極具實用性、推廣性。

技術領域

本發明涉及的是基于聚苯乙烯-二乙烯苯樹脂為載體的真菌毒素免疫親和柱的制備方法，屬于制備技術。

背景技術

鐮刀菌毒素是由真菌毒素產生的次級代謝產物，對人和家畜的健康有很大的危害，廣泛存在于各種糧食作物和加工產品中，多見于潮濕環境中儲藏的發霉糧食中。經常從受污染的糧食和飼料中被檢出的有4種：T-2毒素、HT-2毒素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇DON及玉米赤霉烯酮ZEA。對于糧食制品中鐮刀菌毒素的測定分析方法主要為色譜法，大多需結合前處理步驟，如固相萃取(SPE)。然而，目前的SPE是基于理化功能的表面保留，除獲得目標分析物外易混有其他基質成分，常規的固相萃取技術的缺點是對目標分析物選擇性低。免疫親和柱則是一種具有高選擇性的高效凈化技術，利用抗原抗體的特異性識別和結合實現單個化合物或一類化合物的選擇性萃取。免疫親和柱操作簡便，可重復使用。在我國，雖然免疫親和固相萃取技術在許多實驗室已經廣泛使用，但固相萃取材料還是主要依靠進口。目前市場上存在的免疫親和柱，其填料大多以Sepharose 4B凝膠多糖基質為主，供應廠商單一，使用成本高昂。選擇其他基質作為填料，成為今后免疫親和柱的研究方向。高交聯聚苯乙烯-二乙烯苯(polystyrene-divinylbenzene，簡稱PS-DVB)材料不受pH的限制，機械強度大。一種高效的以聚苯乙烯-二乙烯苯樹脂為載體的真菌毒素免疫親和柱，克服了多糖類基質免疫親和柱機械強度差，pH應用范圍窄和成本高的缺陷，又能實現幾種真菌毒素的同時凈化，大大節約時間和成本。

發明內容

本發明提供一種基于聚苯乙烯-二乙烯苯樹脂為載體的真菌毒素免疫親和柱的制備方法，可以克服上述困難。

本發明是采用以下技術方案來實現的：基于聚苯乙烯-二乙烯苯樹脂為載體的真菌毒素免疫親和柱的制備方法，它包括抗體的制備和純化、基質材料制備、配體偶聯、裝柱四個步驟，其特征在于：取聚苯乙烯-二乙烯苯微球，加入去離子水，在50～70℃水浴中高速攪拌，加入比例為3∶2的濃硫酸與濃硝酸，反應2h，將產物洗滌至pH值呈中性，37℃真空干燥24h，得到硝基聚苯乙烯-二乙烯苯。取硝基聚苯乙烯-二乙烯苯微球，在50～70℃水浴中高速攪拌下，加入2mol/L KOH溶液和適量Na₂S₂O₄反應4h，將產物洗滌至pH值呈中性，37℃真空干燥24h，得到氨基聚苯乙烯-二乙烯苯。取氨基化聚苯乙烯-二乙烯苯微球，用pH7.0的PBS緩沖液分散，超聲30min，加入過量25％戊二醛，在29℃的振蕩水浴鍋中振蕩反應(200r/min)3h，停止活化。然后用pH 5.0的0.2mol/L的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液(PBS)清洗3遍并溶解在此緩沖液中，得到樹脂懸浮液。取1～5mg DON抗體、0.1～1mg T-2、HT-2抗體、0.2～1mg ZEA抗體，將上述抗體加入50％PBS-甘油溶液，再取上述活化過的樹脂材料1mL(約0.3g)，將兩者混合，25℃的振蕩水浴鍋中振蕩反應12h。采用濕法裝柱，每根柱子裝入1mL凝膠，柱子裝好后，用5倍柱床體積的無菌過濾的0.01％NaN₃-PBS過柱，并使用0.01％NaN₃-PBS保存。

本發明的優點和積極效果：

設計新穎，工藝先進，方法獨特，用途廣。不但解決了鐮刀菌毒素在傳統富集過程中存在的基質干擾、特異性低、成本高等問題，并且實現多目標同時凈化，特異性強，機械強度高，pH適用范圍廣，極大地提高了免疫親和柱的使 用效率。本聚苯乙烯-二乙烯苯鐮刀菌毒素多目標免疫親和柱的制備方法使鐮刀菌毒素的多目標凈化變得高效、快速、方便，且極具實用性、推廣性。