[發(fā)明專利]一種從海帶中提取抗氧化肽的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201611136426.5
• 申請(qǐng)日: 2016-12-12
• 公開（公告）號(hào): CN106632590A
• 公開（公告）日: 2017-05-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉乃山;宋立明;夏襯來
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 青島冠龍生物制藥有限公司
• 主分類號(hào): C07K1/36
• 分類號(hào): C07K1/36;C07K1/30;C07K1/18;C07K1/14;A61P39/06
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1.一種海帶抗氧化肽的分離方法，其特征在于：通過加入緩沖液溶解離心制備海帶抗氧化肽粗提液，再經(jīng)過柱平衡、上樣、洗滌、洗脫、柱再生、沉淀、離心、脫水和真空干燥等步驟初步分離純化，得到一種海帶抗氧化肽產(chǎn)品。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備海帶抗氧化肽的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟：

（1）溶解離心：取海帶干粉，先用PBS緩沖液將海帶干粉溶解，攪拌2-8h，10000r/min離心5-60min，取上清液；將沉淀溶于2-10倍（w/v）蒸餾水后繼續(xù)攪拌2-8h后再次10000r/min離心5-60min，取上清液；再將沉淀溶解于2-10倍（w/v）蒸餾水進(jìn)行第三次攪拌，離心后取上清液，作為上柱液;

（2）柱平衡：用平衡緩沖液平衡柱體，用恒流泵控制流速為100-700ml/min，平衡時(shí)間1-5小時(shí);

（3）上樣：將上柱液加入層析柱，恒流泵控制流速為100-700ml/min；上樣結(jié)束后，用平衡緩沖液洗滌層析柱，恒流泵控制流速為200-800ml/min;

洗滌：用洗滌緩沖液洗滌層析柱，恒流泵控制流速為200-800ml/min;

（5）洗脫：洗滌結(jié)束后，用洗脫液洗脫層析柱，恒流泵控制流速為300-900ml/min；洗脫的同時(shí)，使用核酸蛋白檢測(cè)儀粗略測(cè)量流出液100-640nmOD值，當(dāng)OD值接近0.05-0.95時(shí)改用紫外分光光度計(jì)精密測(cè)量OD值，當(dāng)流出液OD值在0.2-0.7以上，開始收集流出液，直到OD值在0.2-0.7以下，停止收集流出液;

（6）柱再生：洗脫結(jié)束后，用氫氧化鈉溶液的再生液洗滌層析柱，之后再用純化水洗滌層析柱，流速均用恒流泵控制在100-1000ml/min;

（7）沉淀：計(jì)量收集流出液體積，轉(zhuǎn)入不銹鋼桶內(nèi)，邊攪邊加入流出液體積2-8倍量(v/v)的冷乙醇，乙醇溫度不超過-5℃，靜置沉淀12-36小時(shí)，至乙醇澄清沉淀物全部沉于不銹鋼桶底部;

（8）離心、脫水：用軟管自然虹吸上層乙醇，下層沉淀物裝入離心杯用低速大容量冷凍離心機(jī)離心，使固液分離，設(shè)定離心轉(zhuǎn)速不低于2500-5000rpm；離心結(jié)束后，棄去上層母液，收集下層固體，按固體物重量1:2-1:9（w/v）比例于離心杯內(nèi)加入無水乙醇脫水1-4次，再按上述步驟離心，收集固體物干燥;

（9）真空干燥：將上述盛有離心固體物的離心杯放置于真空干燥箱，干燥10-35小時(shí)以上，干燥后即得產(chǎn)品。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：步驟（1）中，按干粉重量1:5-1:90（w/v）的比例量取PBS緩沖液，PBS緩沖液pH7.2～7.4，其中NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na₂HPO₄10mmol/L， KH₂PO₄ 2mmol/L。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：步驟（2）中，平衡緩沖液為0.05mol/L乙酸鈉溶液（pH 3.0-7.5）。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：步驟（4）中，洗滌緩沖液為取0.1mol/L乙酸鈉溶液（pH 2.0-9.0）。

6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：步驟（5）中，洗脫液為1.0mol/L氯化鈉溶液（pH2.5-10.0）。

7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：步驟（6）中，再生液為0.1-1.0mol /L氫氧化鈉溶液。