[發明專利]一種高枝化型右旋糖酐蔗糖酶工程菌的構建方法及其表達應用

有效

• 申請號: 201611136122.9
• 申請日: 2016-12-12
• 公開（公告）號: CN106755038B
• 公開（公告）日: 2019-12-27
• 發明（設計）人: 張洪斌;王超;李瑤;李夢琦;胡雪芹
• 申請（專利權）人: 合肥工業大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N1/21;C12N9/10
• 代理公司: 34101 安徽省合肥新安專利代理有限責任公司
• 代理人: 喬恒婷

本發明公開了一種高枝化型右旋糖酐蔗糖酶工程菌的構建方法及其表達應用，其中高枝化型右旋糖酐蔗糖酶工程菌的構建方法是以右旋糖酐蔗糖酶基因為模板，去除3’端的1584bp堿基、保留上游3000bp堿基dex?YG?bMU01后重組轉化到BL21(DE3)大腸桿菌中獲得的BL21(DE3)/dex?YG?bMU01基因工程菌。本發明構建的BL21(DE3)/dex?YG?bMU01右旋糖酐蔗糖酶基因工程菌，合成的右旋糖酐支鏈化程度提高，其中的α(1?3)比例從原來的5％提高到了17％，其水溶液黏度增加，絮凝效果方面得到明顯改良，其產酶仍然保持了較高的活性。

一、技術領域

本發明涉及一種高枝化型右旋糖酐蔗糖酶工程菌的構建方法及其表達應用，屬于基因工程領域。

二、背景技術

右旋糖酐(dextran)，又稱葡聚糖，是蔗糖經腸膜狀明串珠菌發酵后生成的高分子葡萄糖聚合物，主要由α(1-6)糖苷鍵連接，伴有少量α(1-3)和α(1-4)糖苷鍵，也可以通過工程菌生產的右旋糖酐蔗糖酶制備。因其具有安全、無毒、生物相容性、結構特異性等多種優點，在食品、醫學、色譜分析、材料等多個領域都有了廣泛的應用。不同結構的右旋糖酐其物理化學性質都有較大的差異，根據其功能都有其特定的用途，例如由明串珠菌發酵的95％α(1-6)糖苷鍵的右旋糖酐70是目前公認的優良血漿替代品，由面包酵母發酵的右旋糖酐可作為食品添加劑改善食品的口感。右旋糖酐由于其超高的分子量，和鏈上的一些活性官能團，可以吸附分散體系中微粒，形成架橋作用，將分散體系中的微粒絮凝沉降下來，右旋糖酐或者改性右旋糖酐(接枝不同的官能團)在絮凝劑方面有很大的應用價值。

目前國內制糖工業采用的傳統澄清手段主要是采用石灰和二氧化硫為主要清凈劑。混合汁經預灰、一次加熱、硫熏中和、二次加熱后入沉降器，分離出清凈汁和泥汁，泥汁經過濾得濾清汁，它與清凈汁混合再經加熱、多效蒸發成糖漿，再經糖漿硫熏得清糖漿作結晶原料。或者以石灰和二氧化碳為主要清凈劑的蔗汁清凈法。其工藝流程為：混合汁經一次加熱、預灰，然后在加入過量的石灰乳的同時通入二氧化碳進行一次碳酸飽充，使產生大量鈣鹽沉淀，隨即加熱、過濾得一碳清汁，再經第二次碳酸飽充，然后加熱、過濾，得二碳清汁，又經硫熏、加熱、蒸發成糖漿。然后進行硫漂使pH降至5.8～6.4，供結晶之用。大量的二氧化硫和石灰石的使用，不僅需要投入大量資金，同時對環境和人體也會有很大的影響和危害。而使用蔗糖為底物合成的右旋糖酐作為澄清劑，將會使澄清步驟綠色，無污染，更加節約資源。

分析發現，要完善右旋糖酐作為絮凝劑的生產工藝，有2個關鍵性問題尚待解決：①因為右旋糖酐結構多樣性，其功能也是多樣性的，首先要選擇分子量和支鏈化程度適宜的右旋糖酐用作絮凝劑或其絮凝劑前提的研究。②通過基因手段理性設計右旋糖酐技術，要想得到不同結構的右旋糖酐，就要從其上游，右旋糖酐蔗糖酶基因的改造來獲得結構特異的右旋糖酐。通過對右旋糖酐基因序列和其表達蛋白三維結構分析，設計合理的基因序列，獲得所需結構的右旋糖酐。

迄今為止，有關于改造右旋糖酐蔗糖酶基因生產右旋糖酐應用于絮凝劑的研究在國內外文獻未見報道。目前右旋糖酐主要應用于血漿替代品，文獻中大多是對右旋糖酐蔗糖酶催化機理，以及蛋白結構分析等基礎研究報道，應用方面大多是對原始菌株表達的右旋糖酐應用研究。通過分子生物學手段特異性的改造右旋糖酐，國內外均為見報道。基因改造手段制備目的右旋糖酐工業將是以后國際研究熱點和解決問題的關鍵。

三、發明內容

本發明旨在提供一種高枝化型右旋糖酐蔗糖酶工程菌的構建方法及其表達應用，通過該酶從而改良右旋糖酐性質，使其更適合絮凝劑或絮凝劑前提的研究。

本發明高枝化型右旋糖酐蔗糖酶工程菌是以右旋糖酐蔗糖酶基因(GenbankNo.DQ345760)為模板，去除3’端的1584bp堿基、保留上游3000bp堿基dex-YG-bMU01后重組轉化到BL21(DE3)大腸桿菌中獲得的BL21(DE3)/dex-YG-bMU01基因工程菌。