[發明專利]一種皮膚干細胞經異位發育分化為精子的技術方法

有效

• 申請號: 201611135047.4
• 申請日: 2016-12-11
• 公開（公告）號: CN106754661B
• 公開（公告）日: 2020-04-07
• 發明（設計）人: 沈偉;孫源超;程順峰;孫曉鳳;李蘭
• 申請（專利權）人: 青島農業大學
• 主分類號: C12N5/076
• 分類號: C12N5/076;C12N5/074
• 代理公司: 濟寧宏科利信專利代理事務所 37217
• 代理人: 樊嵩

1.一種皮膚干細胞經過體內發育分化為精子的方法，包括將皮膚干細胞誘導分化為原始生殖細胞、將原始生殖細胞植入受體鼠睪丸獲得精子細胞兩個步驟，其特征在于：

1）將皮膚干細胞誘導分化為原始生殖細胞具體為：

①皮膚干細胞準備：分別提取培養了1-2代綠色熒光轉移基因小鼠的皮膚干細胞與野生型小鼠成纖維細胞，并將野生型小鼠成纖維細胞采用絲裂霉素C處理，然后將皮膚干細胞與處理后的成纖維細胞按照質量比1:1的比例混合后待用；

②選用DMEM高糖培養基作為原始生殖細胞誘導培養基，并在該培養基內加入以DMEM高糖總質量計8%~12%質量分數的胎牛血清、以DMEM高糖總體積計40 mIU/ml~60 mIU/ml促卵泡素、80 IU/ml~120 IU/ml白血病抑制因子、15ng/ml~25 ng/ml骨形態發生因子、0.20mmol/L~0.25 mmol/L丙酮酸鈉、0.08 mmol/L~0.12 mmol/L非必需氨基酸，1.5 mmol/L~2.5mmol/L L-谷氨酰胺，0.08 mmol/L~0.12 mmol/L β-巰基乙醇, 8ng/ml~12 ng/ml表皮生長因子, 15ng/ml~25 ng/ml堿性成纖維細胞生長因子, 30ng/ml~50ng/ml干細胞生長因子；培養溫度35℃-38℃，濕度不低于80%，環境中CO₂濃度4%-6%；

③將步驟①獲得的待用混合細胞植入步驟②準備的原始生殖細胞誘導培養基，然后將培養基放置在培養箱中，按常規方式進行培養8-10天，即獲得誘導分化出的原始生殖細胞；

2）將原始生殖細胞植入受體鼠睪丸獲得精子細胞具體為：

①準備受體鼠；

②將1）中步驟③獲得的原始生殖細胞稀釋至0.8×10⁶個/L ~1.2×10⁶個/L，然后利用常規睪丸注射技術將其注射進行受體睪丸曲細精管內，培育至通過常規方法檢測出現典型精子形態的細胞，則所述具有典型精子形態的細胞為所需精子細胞。

2.根據權利要求1所述的一種皮膚干細胞經過體內發育分化為精子的方法，其特征在于：在步驟1）將皮膚干細胞誘導分化為原始生殖細胞和將原始生殖細胞植入受體鼠睪丸獲得精子細胞之間還增加有原始生殖細胞專向培養步驟，具體為：將1）中步驟③獲得的原始生殖細胞放入專向培養基內進行培養，所述專向培養基具體為：以DMEM高糖培養基作為基礎，其內添加以DMEM高糖總質量計8%~12%質量分數的胎牛血清、以DMEM高糖總體積計15ng/ml~25 ng/ml骨形態發生因子、0.20 mmol/L~0.25 mmol/L丙酮酸鈉、0.08 mmol/L~0.12mmol/L非必需氨基酸，1.5 mmol/L~2.5mmol/L L-谷氨酰胺，0.08 mmol/L~0.12 mmol/L β-巰基乙醇, 15ng/ml~25ng/ml表皮生長因子, 30ng/ml~50 ng/ml堿性成纖維細胞生長因子, 30ng/ml~50ng/ml干細胞生長因子；培養時間3-5天，溫度35℃-38℃，濕度不低于80%；環境中CO₂濃度4%-6%。

3.根據權利要求1所述的一種皮膚干細胞經過體內發育分化為精子的方法，其特征在于：原始生殖細胞在受體鼠睪丸內的培育周期為25天-40天。