[發(fā)明專利]一種毛囊干細胞體外分化為卵母細胞的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201611135042.1
• 申請日: 2016-12-11
• 公開（公告）號: CN106754660B
• 公開（公告）日: 2020-04-07
• 發(fā)明（設計）人: 沈偉;孫源超;程順峰;孫曉鳳;李蘭
• 申請（專利權）人: 青島農(nóng)業(yè)大學
• 主分類號: C12N5/075
• 分類號: C12N5/075;C12N5/10
• 代理公司: 濟寧宏科利信專利代理事務所 37217
• 代理人: 樊嵩

本發(fā)明涉及一種毛囊干細胞體外分化為卵母細胞的方法，首先用原始生殖細胞誘導培養(yǎng)基誘導小鼠毛囊干細胞分化為卵子的原始生殖細胞；然后將分化的原始生殖細胞轉(zhuǎn)移到卵母細胞誘導培養(yǎng)基中誘導其向卵子分化，誘導分化的第一階段，出現(xiàn)直徑30μm?50μm的大細胞；誘導分化的第二階段，培養(yǎng)基中會出現(xiàn)直徑不低于50μm的大細胞；誘導分化的第三階段，大細胞呈現(xiàn)典型卵母細胞形態(tài)、有透明帶結構出現(xiàn)、表達卵母細胞特異基因。本發(fā)明通過培養(yǎng)及誘導小鼠毛囊干細胞，成功專向分化為卵母細胞，對機體傷害小、無倫理問題限制，有助于推動干細胞臨床應用，并為干細胞治療不孕不育提供了新思路。

技術領域

本發(fā)明生物醫(yī)學的干細胞與組織工程學技術領域，尤其涉及一種毛囊干細胞體外分化為卵母細胞的方法。

背景技術

據(jù)統(tǒng)計，世界上現(xiàn)有不孕不育人群占育齡婦女的10% 左右；約1/5的婦女處于絕經(jīng)期年齡段，隨著人口老齡化進程加快，越來越多女性將在雌激素匱乏狀態(tài)中度過更長時期；女性由于在工作和生活中面臨的各種壓力，致使卵巢早衰出現(xiàn)年輕化趨勢。在雌性不如動物生殖系統(tǒng)發(fā)育過程中，卵巢內(nèi)絕大多數(shù)卵母細胞在發(fā)育過程中發(fā)生凋亡，因此在雌性生殖周期內(nèi)能夠發(fā)育成熟并排出的卵母細胞相比整個原始卵泡庫來說非常少，同時我們對卵母細胞發(fā)生成熟的調(diào)控機制還知之甚少。因此，通過體外干細胞分化獲得卵母細胞，可以介入卵巢早衰的治療，恢復卵巢功能，以及延緩女性絕經(jīng)期的到來，同時也能使我們更好的理解動物生殖細胞發(fā)生發(fā)育過程及其機制。

綜合最近研究進展，之前的研究大都采用胚胎干細胞（ESC）作為原材料，但是ESC處在哺乳動物個體發(fā)育的早期，在應用上存在倫理限制，并且取材困難，因此采用成體干細胞代替ESC向生殖細胞分化可以更好地解決問題。毛囊干細胞廣泛分布于哺乳動物毛發(fā)中，取材十分方便，對機體傷害最小，同時也不存在倫理問題限制。多項研究指出毛囊干細胞是一類具有自我更新能力及多向分化潛能的成體干細胞。

發(fā)明內(nèi)容

為解決現(xiàn)有技術中存在的上述缺陷并發(fā)揚優(yōu)點，本發(fā)明旨在提供一種采用成體干細胞進行誘導分化培養(yǎng)，對機體傷害小、無倫理問題限制的卵母細胞體外培養(yǎng)方法。

為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術方案：一種毛囊干細胞體外分化為卵母細胞的方法，包括將毛囊干細胞誘導分化為原始生殖細胞、將原始生殖細胞再次誘導分化為卵母細胞兩個步驟，其中：

1）將毛囊干細胞誘導分化為原始生殖細胞具體為：

①原始細胞準備：分別提取培養(yǎng)了1-2代綠色熒光轉(zhuǎn)移基因小鼠的毛囊干細胞與野生型小鼠成纖維細胞，并將野生型小鼠成纖維細胞采用絲裂霉素C處理，然后將毛囊干細胞與處理后的成纖維細胞按照數(shù)量比1:1的比例混合后待用；

②選用DMEM高糖培養(yǎng)基作為原始生殖細胞誘導培養(yǎng)基，并在該培養(yǎng)基內(nèi)加入以DMEM高糖總質(zhì)量計8%~12%質(zhì)量分數(shù)的胎牛血清、以DMEM高糖總體積計40 mIU/ml~60 mIU/ml促卵泡素、80 IU/ml~120 IU/ml白血病抑制因子、15ng/ml~25 ng/ml骨形態(tài)發(fā)生因子、0.20 mmol/L~0.25 mmol/L丙酮酸鈉、0.08 mmol/L~0.12 mmol/L非必需氨基酸，1.5mmol/L~2.5mmol/L L-谷氨酰胺，0.08 mmol/L~0.12 mmol/L β-巰基乙醇, 8ng/ml~12 ng/ml表皮生長因子, 15ng/ml~25 ng/ml堿性成纖維細胞生長因子, 30ng/ml~50ng/ml干細胞生長因子；培養(yǎng)溫度35℃-38℃，濕度不低于80%，環(huán)境中CO₂濃度4%-6%；

③將步驟①獲得的待用混合細胞植入步驟②準備的原始生殖細胞誘導培養(yǎng)基，然后將培養(yǎng)基放置在培養(yǎng)箱中，按常規(guī)方式進行培養(yǎng)8-10天，即獲得誘導分化出的原始生殖細胞；

2）將原始生殖細胞誘導分化為卵母細胞具體為：