[發明專利]一種穩定低表達SMMC7721的細胞系及構建方法

在審

• 申請號: 201611133379.9
• 申請日: 2016-12-10
• 公開（公告）號: CN108611323A
• 公開（公告）日: 2018-10-02
• 發明（設計）人: 劉揚;何牮;王洋
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/85
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

本發明公開一種ALDH18A1低表達的SMMC7721細胞系的構建方法。具體采用shRNA干擾技術構建ALDH18A1穩定低表達的SMMC7721細胞系。經過獲得ALDH18A1shRNA重組質粒、包裝病毒，然后對病毒感染后的細胞進行嘌呤霉素篩選，傳代，建立穩定低表達的SMMC7721?ALDH18A1KD細胞系，最終獲得陽性重組細胞系，能夠低表達ALDH18A1。ALDH18A1穩定低表達的SMMC7721細胞系可作為理想的模型來進行ALDH18A1參與的腫瘤發生發展機制的研究。

技術領域

本發明涉及到細胞生物學技術，具體涉及一種采用ALDH18A1-1ShRNA技術構建ALDH18A1穩定低表達的SMMC-7721細胞系的方法。

背景技術

乙醛脫氫酶(Aldehyde dehydrogenase，ALDH)是近來新發現的癌癥相關基因，ALDH超家族是一類是NADP+依賴的酶，具有多功能的蛋白。目前為止，研究發現至少有19個ALDH基因。人類的ALDH超家族成員有：1A1、1A2、1A3、1B1、1B2、1L1、1L2、3A1、3A2、3B1、3B2、4A1、5A1、6A1、7A1、8A1、9A1、16A1和18A1分別定位于不同染色體區段上。該超家族中多個成員的的活性已證實于細胞的增殖、凋亡、信號轉導、細胞周期等多個生物學過程相關。現階段研究表明，在乳腺癌、結腸癌、白血病、肺癌、肝癌、前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌等多種癌癥中均發現ALDH的表達異常。這些提示ALDH作為癌癥相關的調控酶在腫瘤發生、發展、轉移等方面均有重要作用。

ALDH18A1定位于線粒體的內膜，其在人腎臟、胰腺、卵巢和睪丸等處中高表達，在心臟和骨骼肌、結腸等處中度表達。ALDH18A1包含兩個結構域：N末端的γ-谷氨酰激酶結構域和C末端的γ-谷氨酰磷酸還原酶結構域。ALDH18A1通過催化谷氨酸鹽的還原反應，生成△－吡咯啉－5－羧基合成酶(P5C)，P5C再進一步轉變為鳥氨酸。該通路涉及脯氨酸和精氨酸的從頭合成，作為能量代謝通路的關鍵酶在腫瘤發生發展中起到至關重要的作用。ALDH18A1的突變可引起一系列如低脯/鳥氨酸血癥、低精氨酸血癥和伴有神經退行性變及結締組織異常的高氨血癥等代謝異常疾病。

癌癥現階段已成為全球健康的首要殺手，每年都有大量人員因癌癥導致死亡。其中，肝癌是位居第二的致死性癌癥，同時也是近年來發病率一直呈上升趨勢的癌癥種類之一。現階段研究表明，肝癌的發生發展與能量代謝異常有著密切的關系。因此建立一系列人肝癌細胞系會為肝癌發生發展的機制研究和臨床用藥指導提供研究基礎。

RNA干擾技術是近些年來發展起來的一項基因沉默技術，該技術的出現為研究基因的功能、信號通路及基因治療等方面都提供了新的研究手段，與傳統的基因工程技術相比，其具有特異性強、級聯放大等優點。但是siRNA為化學合成，轉染后在細胞內可被降解，從而導致沉默效率較低；而shRNA可視為在載體上連接siRNA序列，將載體轉入細胞后在細胞內轉錄生成shRNA，細胞內的Dicer酶將其修飾后生成相應的siRNA，從而發揮RNAi作用，而且干擾效果更穩定、更持久。常用的構建shRNA的病毒表達載體有腺病毒載體、慢病毒載體等，這些病毒載體的作用機制與質粒載體相似，但是病毒相對于質粒具有感染效率高的特點，從而解決了質粒載體轉染效率低等缺陷。

發明內容

本發明的目的旨在提供一種ALDH18A1低表達的SMMC-7721細胞系的構建方法。本發明采用ALDH18A1shRNA干擾技術構建ALDH18A1穩定低表達的SMMC-7721細胞系，即SMMC-7721ALDH18A1KD細胞系。

本發明通過下述技術方案實現：

本發明的一方面在于：ALDH18A1穩定低表達的SMMC-7721細胞系的構建方法，包括如下步驟：

(a)病毒的構建及富集