[發(fā)明專利]一種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測金藻的方法及試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201611131807.4
• 申請日: 2016-12-09
• 公開（公告）號: CN106701927B
• 公開（公告）日: 2020-09-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 龔迎春;王賢慧;展雪玲;胡強(qiáng)
• 申請（專利權(quán)）人: 國投生物科技投資有限公司;中國科學(xué)院水生生物研究所
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 北京智為時代知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11498
• 代理人: 王加嶺;楊靜

本發(fā)明首先提供金藻CoI基因作為分子標(biāo)記應(yīng)用在環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測金藻中，并繼續(xù)提供一組環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物，其可特異性環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增所述的分子標(biāo)記。最后提供一種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測金藻的方法，以待測樣品質(zhì)粒和基因組DNA為模板，利用上述的特異性引物組進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)。所述引物特異性強(qiáng)，靈敏度高，且具有很好的重復(fù)性。該方法可檢測出的最低濃度分別可達(dá)到100copies/μL金藻線粒體CoI基因的存在和1000cells/mL金藻細(xì)胞的存在，比傳統(tǒng)PCR技術(shù)的敏感度提高了1000倍，很好的解決了敏感性問題，對微藻培養(yǎng)污染物的早期監(jiān)測具有重要意義。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及微生物分子檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測金藻的方法及試劑盒。

背景技術(shù)

金藻是小球藻大規(guī)模培養(yǎng)中存在的一種污染最嚴(yán)重的原生動物，它是一種鞭毛蟲-Poterioochromonas sp.。該鞭毛蟲具有自養(yǎng)與混合營養(yǎng)的特點(diǎn)，極易感染并快速吞噬小球藻，一經(jīng)感染，可使小球藻大規(guī)模培養(yǎng)在短時間內(nèi)完全潰敗，從而給小球藻的大規(guī)模培養(yǎng)帶來極大危害。因此對于小球藻培養(yǎng)中金藻的早期快速監(jiān)測和分子鑒定方法的確定至關(guān)重要。

目前對金藻研究多局限于對其進(jìn)行分離培養(yǎng)以及其對水華藻種的吞噬習(xí)性方面的研究，而對其進(jìn)行早期監(jiān)測方面的研究甚少，只停留在傳統(tǒng)的顯微鏡觀察、DNA一代測序及聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)階段。傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)觀察靈敏度低，最低限度為10⁴cells/mL，在原生動物大量存在時適用，并且因?yàn)樵鷦游锓N類繁多，數(shù)量龐大，除了已知的形態(tài)學(xué)知識外，有很多形態(tài)上難以區(qū)分的物種，而DNA一代測序及聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)存在檢測效率低，操作繁瑣，耗費(fèi)時間，假陽性概率大，經(jīng)常影響對實(shí)際情況的判斷，錯過最佳污染控制的時機(jī)，不適合基層和現(xiàn)場檢測。因此，建立一種簡單且靈敏的金藻早期監(jiān)測方法尤為重要。

LAMP(環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增)是由Notomi于2000年開發(fā)的一種新型核酸擴(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)利用4種不同的特異性引物識別靶基因的6個特定區(qū)域，借助具有鏈置換作用的Bst DNA聚合酶，在恒等溫條件下進(jìn)行靶序列高效擴(kuò)增，可合成10⁹-10¹⁰個數(shù)量級的靶標(biāo)DNA。該技術(shù)避免了常規(guī)PCR對循環(huán)溫度的特殊要求，并因其高效性、簡易行、成本低廉且檢測周期短等特點(diǎn)提升了它的應(yīng)用價(jià)值。到目前為止，還沒有將LAMP技術(shù)有效用于大規(guī)模微藻培養(yǎng)中的重要污染物金藻的早期監(jiān)測。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是在儀器設(shè)備有限的環(huán)境中，提供一種能簡便快捷準(zhǔn)確的檢測到金藻的方法，以實(shí)現(xiàn)對大規(guī)模微藻培養(yǎng)中的重要污染物金藻進(jìn)行早期監(jiān)測。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明解決的第一個技術(shù)問題是：采用金藻CoI基因應(yīng)用在環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測金藻中。一般在選擇檢測目的基因時，對于真核生物，優(yōu)先考慮的都是真核生物普遍存在的18S rRNA，但此基因具有高保守性，不適用于進(jìn)行物種特異性分析。而本發(fā)明經(jīng)過反復(fù)序列比對后，發(fā)現(xiàn)采用CoI基因作為分子標(biāo)記進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增引物的設(shè)計(jì)，可以有效的將金藻在微藻培養(yǎng)過程中即使有其他污染原生動物存在的條件下也可以鑒定出來。CoI基因，細(xì)胞色素氧化酶I(CoI cytochrome c oxidase I)基因，這部分DNA序列能夠準(zhǔn)確區(qū)分出物種差異，具有每個物種的特異性，就像物種的“身份證”編號。在藻類培養(yǎng)過程中，會應(yīng)對出現(xiàn)不同種微生物的污染，為了明確污染物的信息，本發(fā)明將金藻CoI基因作為目標(biāo)監(jiān)測的分子標(biāo)記。同時由于原生動物基因序列相似度較大，如直接采用DNA直接測序及聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，檢測效率低，檢測結(jié)果會出現(xiàn)假陽性的情況。故而本發(fā)明繼續(xù)采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，將金藻CoI基因作為分子標(biāo)記進(jìn)行特異性篩選(如序列SEQ IDNo.7所示)和設(shè)計(jì)引物，繼而解決了第二個技術(shù)問題，進(jìn)一步提供一組環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物，其可特異性環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增所述的分子標(biāo)記。