[發明專利]畢赤酵母誘導表達磷脂酶C的方法

在審

• 申請號: 201611130102.0
• 申請日: 2016-12-09
• 公開（公告）號: CN108611336A
• 公開（公告）日: 2018-10-02
• 發明（設計）人: 楊倚銘;吳清杭;關惠琴;常桂芳
• 申請（專利權）人: 豐益（上海）生物技術研發中心有限公司
• 主分類號: C12N9/16
• 分類號: C12N9/16;C12N15/81;C12R1/84
• 代理公司: 上海智信專利代理有限公司 31002
• 代理人: 王潔

本發明提供了一種提高酵母表達外源性蛋白的方法，所述方法包括于32～35℃誘導表達所述外源性蛋白。采用本發明的方法，能夠使得目標蛋白的產量高出低溫控制工藝，甚至可高出30?80％，節能降耗顯著，非常容易實現發酵放大和產業化。

技術領域

本發明涉及酵母發酵表達外源性蛋白，具體涉及一種能顯著提高畢赤酵母誘導表達磷脂酶C產量的方法。

背景技術

磷脂酶C(phospholipase C，簡稱PLC)是一類可催化水解磷脂C3的磷脂酰鍵的水解酶，在醫藥、油脂精煉、食品加工、磷脂改性等領域均有廣泛應用。而甲醇型畢赤酵母作為磷脂酶C表達的平臺，其發酵工藝通常包含三部分，批發酵階段、甘油補料階段以及甲醇誘導階段，其中甲醇誘導階段的溫度控制工藝是影響外源重組蛋白表達產量高低的關鍵因素之一。據大量的文獻報道，畢赤酵母甲醇誘導階段的誘導溫度要低于30℃進行誘導表達，誘導溫度一旦高于30℃，會加劇甲醇對細胞的毒害作用，增加了內質網壓力，不利于新生肽鏈的正確折疊，并造成細胞死亡，使得產量急劇下降^[1,2,3,4]，因此畢赤酵母誘導表達外源蛋白時通常需要控制在低溫條件，常為20-28℃，極個別工藝誘導溫度甚至低至12℃，比如重組人復合α干擾素在20℃誘導的單體量和活性分別比30℃的提高7.2倍和38.7倍^[5]，HAS-IFN-α2b在20℃誘導的表達量比30℃提高2.16倍^[6]，融合南極假絲酵母脂肪酶B在12℃誘導的表達量比30℃提高1倍，菌體死亡率降低66.7％^[7]。瑞普酶在20℃誘導的表達量比30℃提高35％，菌體死亡率可降低50.1％[8]，β-木糖苷酶的最佳誘導溫度也控制在20℃^[9]。

由此可見，畢赤酵母表達外源蛋白的特性是需要控制較低的溫度才能達到產量最大化，然而畢赤酵母表達外源蛋白的另一特性是高密度培養，細胞干重往往達到了200g/L以上，發酵過程中生成了大量的發酵熱，使得在工業規模級別發酵時溫度通常難以控制到28℃以下，發酵罐尺度越大，最優溫度條件與現實條件這個矛盾越突出，因此一旦從小試放大到生產，一方面溫度達不到最優控制條件導致蛋白產量會急劇降低，另一方面為了降低溫度會額外消耗大量的冷卻水而造成了大量能源浪費，生產成本增加，生產效益變差，這是畢赤酵母表達外源蛋白時所遇到的重大產業化難題。

[1]林俊涵.畢赤酵母高密度發酵工藝的研究[J].中國生物工程雜志，2009，29(5)：120-125.

[2]鐘永軍.低溫培養增加畢赤酵母的外源蛋白產量的機制研究[D].博士論文，中國科學技術大學，2014.

[3]Daly R,Hearn M T W.Expression of heterologous proteins in Pichiapastoris:a useful experimental tool in protein engineering and production[J].J Mol Recoginit,2005,18(2):119-138.

[4]Zhong Y.Yang L.et al.High-temperature cultivation of recombinantPichia pastoris increases endoplasmic reticulum stress and decreasesproduction of human interleukin-10[J].Microb Cell Fact,2014,13:153.

[5]史琪琪，郝玉有，吳康華.誘導相溫度對畢赤酵母表達重組人復合α干擾素聚合的影響.生物工程學報，2006,22(2)：311-315.