[發(fā)明專利]藥用激肽原酶及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201611129081.0
• 申請日: 2016-12-09
• 公開（公告）號: CN107058269B
• 公開（公告）日: 2020-03-31
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 馬永;王俊
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇眾紅生物工程創(chuàng)藥研究院有限公司
• 主分類號: C12N9/64
• 分類號: C12N9/64;A61K38/48;A61P13/12;A61P9/10
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• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明涉及藥用激肽原酶（KLK1）及其制備方法和應(yīng)用，所述激肽釋放酶中不含有組分KLK1c。豬胰臟來源的組織激肽釋放酶是由3種不同糖基化程度的組分所組成，蛋白電泳分析是呈3條條帶，依照分子量由大到小依次命名為KLK1b、KLK1a、KLK1c，其中，組分KLK1c的特征是糖基化程度最低，在三種組分中的比活最低。本發(fā)明提供的去除了KLK1c組分的組織激肽釋放酶，和現(xiàn)有市場上的豬胰臟來源的組織激肽釋放酶相比，純度及穩(wěn)定性更高，生物活性更高，藥效好且副作用更小。同時，本發(fā)明提供了一種豬組織激肽釋放酶的精純方法，解決了KLK1b，KLK1a和KLK1c分離困難、無法產(chǎn)業(yè)化的問題。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及蛋白類藥物，特別是藥用激肽原酶及其制備方法和其在藥物制備中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

激肽原酶，又稱激肽釋放酶(kininogenase)或血管舒緩素(kallidinogenase)，它是屬于絲氨酸蛋白酶的一種，存在于各種組織和生物液體中，催化大分子前體物(激肽原，Kininogen)釋放生物活性肽(激肽，Kinin)。激肽原酶的生理效應(yīng)包括使毛細(xì)血管和動脈血管舒張以及通透性增加，使冠狀動脈、腦、視網(wǎng)膜處的血流供應(yīng)增加，適用于高血壓冠狀血管以及動脈血管硬化等癥，對心絞痛、血管痙攣、血栓性閉塞性脈管炎、凍瘡以及創(chuàng)傷等癥也有治療作用。同時，激肽原酶也可以作為活化因子，使纖溶酶原激活成纖溶酶，將不溶性的纖維蛋白水解成可溶性的小肽，從而對腦梗塞、動脈粥樣硬化等起到治療作用，并用于治療血栓、預(yù)防血栓再形成(G.M.Yousef,E.P.Diamandis Clin Biochem,2003(36):443-452)。體外研究顯示，激肽原酶對離體動脈具有舒張作用，并可抑制血小板聚集、增強血細(xì)胞變形能力和氧解離能力。動物試驗顯示，激肽原酶靜脈注射可增加麻醉犬椎間、頸總和股動脈血流量，增加麻醉犬后肢、家兔肌肉血流量。因此，激肽原酶在人類微循環(huán)障礙及輕-中度急性血栓性腦梗死等疾病的治療中具有較高的應(yīng)用價值。

國內(nèi)市場上現(xiàn)有的激肽原酶藥物分為兩類：一類是從豬胰臟中提取的激肽原酶，它來源廣泛。另一類是從新鮮人尿中提取精制的人尿激肽原酶。其中從豬胰臟提取的激肽原酶的相關(guān)產(chǎn)品目前市場上主要有麗珠醫(yī)藥、上海第一生化、沈陽濟世、河南靈佑、南昌萬華、濟南維爾康，常州千紅。但是市售豬胰激肽原酶注射液使用時注射部位常有紅腫、疼痛的癥狀，并且，申請人也在大鼠急性缺血性腦卒中實驗中發(fā)現(xiàn)有大鼠在用藥后死亡的情況，因此，申請人推測在現(xiàn)有市售產(chǎn)品中有副作用較大的成分存在。

發(fā)明內(nèi)容

解決的技術(shù)問題：本發(fā)明主要解決了如何進一步提高豬胰臟來源激肽原酶產(chǎn)品質(zhì)量的問題，提供了一種活性更高、穩(wěn)定性更好的激肽原酶；同時解決了豬胰臟來源激肽原酶分離純化困難，無法產(chǎn)業(yè)化的問題，提供了一種可以應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)制備的分離純化KLK1b，KLK1a和KLK1c單組分的方法。

技術(shù)方案：

豬胰臟來源的激肽原酶是由3種不同糖基化程度的組分所組成，蛋白電泳分析是呈3條條帶，依據(jù)分子量由大到小依次命名為KLK1b、KLK1a、KLK1c。

目的之一是提供一種激肽原酶(KLK1)，所述激肽原酶中不含有組分KLK1c，所述KLK1c是在豬胰臟來源的KLK1的SDS-PAGE蛋白電泳時三條帶中分子量最低的條帶。

優(yōu)選的，上述激肽原酶(KLK1)，其由組分KLK1b、KLK1a中的一種或兩種組成。所述組分KLK1b是在豬胰臟來源的KLK1的SDS-PAGE蛋白電泳時三條帶中分子量最高的條帶，所述KLK1a是在豬胰臟來源的KLK1的SDS-PAGE蛋白電泳時三條帶中分子量第二的條帶。

最優(yōu)選的，上述激肽原酶(KLK1)，其為KLK1b。

本發(fā)明的另一個目的是，提供一種激肽原酶KLK1的精純方法，包括如下步驟：

步驟1，激肽原酶溶液用陰離子交換色譜柱純化，梯度洗脫；