[發明專利]一種大腸桿菌高強度組合啟動子及其應用

有效

• 申請號: 201611126585.7
• 申請日: 2016-12-09
• 公開（公告）號: CN106591310B
• 公開（公告）日: 2019-10-25
• 發明（設計）人: 周景文;陳堅;周勝虎;堵國成;李華鐘
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 彭素琴

本發明公開了一種大腸桿菌高強度組合啟動子及其應用，屬于合成生物技術領域。本發明提供了高轉錄強度啟動子P_ssrA、P_dnaKJ、P_grpE、P_alsRBACE和高翻譯強度啟動子P_rpsT。分別將P_ssrA、P_dnaKJ、P_grpE、P_alsRBACE和P_rpsT融合后得到4種具有高表達強度的組合啟動子。該組合啟動子的最高強度為10mM阿拉伯糖誘導的P_BAD啟動子的1.7倍。該組合啟動子是一種安全且高效的基因表達元件。

技術領域

本發明涉及一種大腸桿菌高強度組合啟動子及其應用，屬于合成生物技術領域。

背景技術

作為基因表達的第一個控制元件，通過調控啟動子的強度來控制其下游基因的表達水平成為了最直接有效的手段。在代謝工程改造過程中，模塊化等策略利用不同拷貝數的質粒和IPTG誘導的啟動子成功的對代謝路徑的多個基因表達水平進行了微調，極大地增加了目的產物產量。

目前，大腸桿菌中最常用的是一系列的誘導型啟動子，然而由于誘導型啟動子的數量限制，因此這些啟動子往往難以做到對每一個基因表達強度進行精確調控。微生物的基因組上攜帶有大量的天然啟動子，這些啟動子強度多樣，具有應用于代謝工程改造的巨大潛力。然而，由于大部分組成型啟動子的強度未知，以及與強度對應的啟動子精確序列未知使得直接利用組成型啟動子進行基因表達困難重重。此外大部分的天然啟動子的轉錄強度于基因的翻譯強度不統一，往往具有高轉錄水平的啟動子翻譯的蛋白質卻并不高，而低轉錄水平的啟動子卻擁有較高的蛋白質表達水平。基因組上往往多個啟動子、增強子和衰減子等元件共同調節一個基因的表達，因此不同長度的啟動子區域其功能也不盡相同。如何找到具有高轉錄強度和高翻譯強度的組成型啟動子成為了關鍵。

發明內容

為了解決上述問題，本發明首先提供了一組大腸桿菌組成型啟動子，明確測定出其轉錄強度和翻譯強度，提供了其明確的DNA序列。本發明為避免基因表達過程中的誘導劑添加提供了選擇，同時可用于調節多基因的表達途經，控制菌體代謝流向。

所述大腸桿菌組成型啟動子的核苷酸序列如SEQ ID NO.6～9任一所示。

本發明還提供一種表達載體，具有核苷酸序列如SEQ ID NO.6～9任一所示的啟動子。所述表達載體的骨架包括常見的大腸桿菌的表達載體。

本發明提供應用所述啟動子構建的重組菌。

在本發明的一種實施方式中，所述重組菌的宿主包括各種現有大腸桿菌表達宿主。

在本發明的一種實施方式中，應用所述啟動子構建的重組菌，是利用所述的啟動子連接目的基因，構建重組質粒，并在宿主中表達。

在傳統的基因工程研究中，誘導型啟動子常常被用來表達相關基因，然而由于需要添加誘導劑和難以實現同時對多個基因表達強度進行微調，誘導型啟動子難以應用于多基因表達途徑。來源于基因組的組成型啟動子往往由于其表達強度較低同樣難以滿足要求。本發明提供的4種具有梯度強度的高強度組合啟動子不需要額外的添加誘導劑，具備高轉錄強度和高翻譯強度，同時其具有一定的強度梯度(啟動子強度跨度為7.7倍)可用于對多基因表達途徑進行微調。

具體實施方式

材料與方法

大腸桿菌JM109用于質粒構建，大腸桿菌K12MG1655用于表達蛋白測定啟動子強度。

實施例1