[發明專利]一種喜樹堿化合物作為拓撲異構酶抑制劑在治療慢性肝臟疾病藥物中的應用

在審

• 申請號: 201611126544.8
• 申請日: 2016-12-09
• 公開（公告）號: CN106727560A
• 公開（公告）日: 2017-05-31
• 發明（設計）人: 陳渝萍;汪辛;程江;張艷軍
• 申請（專利權）人: 西南交通大學
• 主分類號: A61K31/4745
• 分類號: A61K31/4745;A61P1/16
• 代理公司: 成都信博專利代理有限責任公司51200
• 代理人: 王沙沙,崔建中

技術領域

本發明涉及藥物領域，具體涉及一種喜樹堿化合物作為拓撲異構酶抑制劑在治療慢性肝臟疾病藥物中的應用。

背景技術

肝纖維化是肝臟遭受各種病因引起的慢性損傷后的修復反應，是肝硬化早期的可逆階段；目前唯有通過肝移植對肝硬化進行治療，因此，對肝纖維化的防治極其重要；肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)是位于肝臟血竇中一類富含維生素A的間充質細胞；在正常肝臟中肝星狀細胞HSC處于不分裂靜息狀態；當肝臟受損時，肝星狀細胞HSC為各類刺激因素激活、轉變成旺盛增殖和過度合成細胞外基質蛋白的肌成纖維母(myofibroblastic,MF)表型細胞；活化態肝星狀細胞HSC的大量擴增在肝纖維化發生過程中占有非常重要的地位；因此通過抑制炎癥反應、對抗氧化應激、調節相關刺激細胞因子的活性和信號傳導等途徑抑制肝星狀細胞HSC的增殖、活化和誘導其凋亡已經成為治療肝纖維化的重要手段；目前有人嘗試使用紫杉醇、姜黃素、10-羥基喜樹堿(HCPT)和一氧化氮(NO)類等藥物來抑制活化態肝星狀細胞HSC的增殖和細胞外基質ECM的沉積；還有采用RNAi技術沉默I型膠原蛋白基因的報道。

發明內容

本發明的目的在于提供一種喜樹堿化合物作為拓撲異構酶抑制劑在的應用，所述抑制劑能夠抑制活化態肝星狀細胞HSC的糖酵解代謝活動、從而有效逆轉HSC為靜息態表型。

本發明采用的技術方案是：一種喜樹堿化合物作為拓撲異構酶抑制劑在治療慢性肝臟疾病藥物中的應用，該化合物化學式為C₂₀H₁₆N₂O₄，相對分子量為348.34，CAS號：7689-03-4，該化合物為成都蘭貝植化有限公司產品；該化合物是由珙桐科旱蓮屬植物喜樹的根、皮、果實提取制得的生物堿，由喜樹根或果粉以有機溶劑提取而得，呈淡黃色針狀結晶；其結構式如下所示：

該抑制劑由上述化合物溶于二甲基亞砜組成。

進一步的，所述抑制劑對活化態肝星狀細胞缺氧因子HIF-1-α有抑制作用。

進一步的，所述抑制劑對活化態肝星狀細胞中糖酵解限速酶基因表達有抑制作用。

進一步的，所述抑制劑對肝星狀細胞中糖酵解代謝活動有抑制作用。

進一步的，所述抑制劑對肝星狀細胞從活化態向靜息態表型逆轉有促進作用。

所述抑制劑由以下方法制備，將2mg喜樹堿CPT溶于10ml DMSO溶液中充分溶解制備成原始濃度為200μg/ml的細胞母液；將上述配置好的抑制劑母液用DMSO進行梯度稀釋，使抑制劑的最終濃度分別為：0.25μg/ml、0.125μg/ml 0.062μg/ml、0.031μg/ml、0.016μg/ml、0.008μg/ml、0.004μg/ml、0.002μg/ml。

本發明通過細胞計數試劑盒分析喜樹堿CPT抑制劑的細胞毒性；取和不同濃度的CPT溶液共孵育48小時的大鼠活化態肝星狀細胞株HSC-T6、人乳腺癌細胞株Hela細胞制備總蛋白；然后以蛋白質印跡法Western Blot檢測細胞中α-SMA、PKM2、HIF-1-α蛋白含量；取和CPT共孵育48小時的大鼠活化態肝星狀細胞株HSC-T6和原代活化態HSC細胞，制備細胞總RNA，以QRT-PCR檢測細胞中Pkm、α-Sma、Collagen1a1基因的RNA表達水平；以DMSO和10-羥基喜樹堿HCPT作為藥物處理對照組。

實驗結果表明：低劑量的喜樹堿可以通過削弱活化態肝星狀細胞中缺氧因子HIF-1-α的蛋白水平而抑制其對下游一系列糖酵解相關基因(如Pkm)的轉錄調控活性，進而減退細胞的糖酵解代謝活動，最終抑制細胞中典型肌成纖維母細胞MF表型標記分子基因(如α-Sma)的表達；喜樹堿的這一抑制作用表現出對活化態肝星狀細胞細胞的選擇性；而已報道的抗肝纖維化藥物10-羥基喜樹堿雖然對活化態肝星狀細胞有相當的細胞毒性，但在不高于半抑制濃度(IC50藥物濃度)時并不抑制細胞中缺氧因子HIF-1-α活性和糖酵解限速酶PKM2及MF表型代表標記分子ɑ-SMA的蛋白水平。

本發明的有益效果是：

(1)本發明涉及的抑制劑特異性好，針對性強，能夠通過抑制活化態肝形狀細胞HSC的糖酵解代謝活動有效逆轉HSC為靜息態表型；

(2)本發明涉及的抑制劑作為治療肝纖維化的藥物能夠在引起更低的炎癥反應及毒副作用的情況下達到治療效果；

(3)本發明結構相對簡單，制備方便。