[發(fā)明專利]一種三七發(fā)狀根系制備方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201611125480.X
• 申請(qǐng)日: 2016-12-09
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108220326A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-06-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張宗申;劉志偉;李剛
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 安徽紅果春生物制藥有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/82
• 分類號(hào): C12N15/82;A01H4/00
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

本發(fā)明涉及一種三七發(fā)狀根系制備方法，屬于醫(yī)藥制備技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明三七發(fā)狀根系制備方法為：(1)在無(wú)菌的條件下，將培養(yǎng)出的顆粒狀三七愈傷組織輕輕敲碎，形成均勻顆粒，然后在0.5mmol/L CaCl₂+0.1g/L活性炭的液體中處理10min，用無(wú)菌水沖洗3?5次，然后再用0.1mmol/L EDTA溶液處理5min，用無(wú)菌水沖洗3?5次，放置在不含任何激素的MS固體培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)條件為25±1℃，黑暗。預(yù)培養(yǎng)后的愈傷組織將用于菌液侵染，獲得轉(zhuǎn)化三七愈傷組織。(2)在無(wú)菌操作臺(tái)上，用鑷子將預(yù)培養(yǎng)后的三七愈傷組織轉(zhuǎn)移到制備好的發(fā)根農(nóng)桿菌的菌液中侵染30 min，90r/min、28℃。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種三七發(fā)狀根系制備方法，屬于生物醫(yī)藥制備技術(shù)領(lǐng)域。。

背景技術(shù)

三七（Panax notoginseng F. H. Chen）為五加科人參屬植物。明代著名藥學(xué)家李時(shí)珍稱其 為“全不須”。清朝藥學(xué)著作《本草綱目拾遺》中記載“人參補(bǔ)氣第一， 三七補(bǔ)血第一”，味同而功亦等，故稱人參、三七為中藥中之最珍貴者。《中藥大辭典》（1997年版）“ 三七功用補(bǔ)血，去瘀損，止血，能通能補(bǔ)，功效最良，是方藥中之最珍貴者。三七生吃，去瘀生新，消腫定痛，并有止血不留瘀血，行血不傷新的優(yōu)點(diǎn)；熟服可補(bǔ)益健體。”三七是多種藥物的主要成分，如云南白藥、三七通舒膠囊、三七止血膠囊等，因此三七被人們譽(yù)為“人參之王”。三七市場(chǎng)需求量與日俱增。

在生物工程與基因技術(shù)發(fā)展的同時(shí)，利用發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)藥用植物產(chǎn)生的發(fā)狀根能合成該植物體中有效藥用成分。對(duì)其發(fā)狀根進(jìn)行離體擴(kuò)增培養(yǎng)，因其生長(zhǎng)迅速、穩(wěn)定性強(qiáng)、變異性弱等特點(diǎn)成為實(shí)現(xiàn)瀕危藥用植物資源可持續(xù)發(fā)展的有效途徑之一。并且發(fā)狀根培養(yǎng)不受環(huán)境、生態(tài)、氣候等條件的限制，所以，利用發(fā)狀根培養(yǎng)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)三七發(fā)狀根從而替代野生植物資源，不但可以緩解日益增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求，而且解決了栽培困難，病蟲(chóng)害多，產(chǎn)量低且不穩(wěn)定等難題。也為三七等民族藥的現(xiàn)代化工業(yè)生產(chǎn)提供了新的思路。因此，建立三七發(fā)狀根培養(yǎng)體系大量生產(chǎn)三七藥用原材料具有重要意義。

研究表明，發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)化藥用植物可誘導(dǎo)其發(fā)狀根產(chǎn)生，已成功的利用Ri質(zhì)粒對(duì)包括27科55屬的許多草本植物和一些林木與果樹(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，如金鐵鎖、毛白楊等是迄今發(fā)狀根誘導(dǎo)比較成功的例子。發(fā)狀根培養(yǎng)與傳統(tǒng)栽培獲得中草藥原材料相比具有如下優(yōu)點(diǎn)：（1）發(fā)狀根生長(zhǎng)速度快、次生代謝產(chǎn)物含量高；(2)發(fā)狀根中染色體和次生代謝產(chǎn)物合成相對(duì)穩(wěn)定； (3)所得的產(chǎn)物可從培養(yǎng)體系內(nèi)直接提取、回收和利用，簡(jiǎn)化生產(chǎn)步驟；(4)不受病蟲(chóng)害、地理和季節(jié)等各種環(huán)境因素的制約；(5)有利于生物轉(zhuǎn)化，細(xì)胞篩選，控制新成分的合成，得到價(jià)值更高的產(chǎn)品；(6)節(jié)省大量種植原料的農(nóng)田。正是因?yàn)榘l(fā)狀根具有諸多優(yōu)點(diǎn)，從而為其工業(yè)化生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)中草藥原材料提供了保證，成為繼組織培養(yǎng)和細(xì)胞培養(yǎng)之后現(xiàn)代生物技術(shù)領(lǐng)域中重要的研究與開(kāi)發(fā)熱點(diǎn)。

利用植物發(fā)狀根進(jìn)行天然物質(zhì)的生產(chǎn)已經(jīng)被人類廣泛關(guān)注，通過(guò)發(fā)狀根培養(yǎng)已經(jīng)分離出生物堿類、甙類、黃酮類、醌類和一些重要的酶等。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，目前國(guó)內(nèi)外已對(duì)23科50余種藥用植物進(jìn)行發(fā)狀根制備的研究，建立培養(yǎng)體系，獲得次生代謝產(chǎn)物。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是公開(kāi)一種三七發(fā)狀根系制備方法。

本發(fā)明采取的技術(shù)方案：

取三七葉片為外植體進(jìn)行消毒、脫分化處理，獲得較好的三七愈傷組織，使用含有Ri質(zhì)粒的發(fā)根農(nóng)桿菌(ATCC11325，保藏單位縮寫和菌種編號(hào))侵染愈傷組織后，轉(zhuǎn)入到共培養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行共培養(yǎng)，然后進(jìn)行除菌培養(yǎng)，在三七愈傷組織處生長(zhǎng)出三七的發(fā)狀根，將具有發(fā)狀根的愈傷組織轉(zhuǎn)入擴(kuò)增培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)狀根的擴(kuò)大培養(yǎng)。