[發(fā)明專利]一種間充質干細胞因子大規(guī)模制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201611124354.2
• 申請日: 2016-12-08
• 公開（公告）號: CN106754639B
• 公開（公告）日: 2020-06-09
• 發(fā)明（設計）人: 雷云霆;董白翔
• 申請（專利權）人: 北京銀豐鼎誠生物工程技術有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N5/0797;C07K1/14;C12M3/00;C12M1/12;C12M1/00
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 王玉松

1.一種間充質干細胞因子大規(guī)模制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）間充質干細胞的體外培養(yǎng)：選取間充質干細胞，經(jīng)體外原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)至4代后，將4代細胞消化計數(shù)，轉至細胞工廠進行擴增培養(yǎng)；

（2）間充質干細胞因子的誘導分泌：當擴增培養(yǎng)的細胞長至匯合度70～85％時，棄掉原培養(yǎng)基，添加誘導培養(yǎng)基至細胞工廠，繼續(xù)培養(yǎng)，收集誘導培養(yǎng)基；

（3）間充質干細胞因子的分離純化：將收集的誘導培養(yǎng)基通過中空纖維濾膜進行循環(huán)過濾5-8遍，收集第一粗純液，將第一粗純液泵至切向流超濾膜包，循環(huán)過濾至第一粗純液體積濃縮為原體積的1/30-1/60，然后向濃縮粗純液中加入PBS緩沖液補至原體積得到第二粗純液，繼續(xù)泵至切向流超濾膜包循環(huán)過濾至第二粗純液體積濃縮為原體積的1/40-1/60后，向第二濃縮粗純液中加入生理鹽水補至原體積得到第三粗純液，繼續(xù)超濾至第三粗純液體積濃縮為原體積的1/30-1/50，收集濃縮濾液得間充質干細胞因子濃縮液；

其中，所述誘導培養(yǎng)基由誘導劑和混合培養(yǎng)基配置而成，所述混合培養(yǎng)基由體積比為30-80:19.8-68.5:0.2-1.5的1500-3000mg/L的DMEM、0.01-0.03M的PBS緩沖液和150-300mM的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺水溶液組成，所述誘導劑包括的組分及各組分在誘導培養(yǎng)基中的濃度如下：10-20mmol/L的HEPES、1-2g/100ml的D-葡萄糖和40-70μmol/L的L-維生素C；

所述誘導劑還包括如下濃度的組分：5-7mg/ml的硫代甘油和0.8-1.3mmol/L的吡哆醇鹽酸鹽；

間充質干細胞因子誘導分泌的具體方法如下：

當擴增培養(yǎng)的細胞長至匯合度70～85％時，棄掉原培養(yǎng)基，添加原培養(yǎng)基一半體積的誘導培養(yǎng)基至細胞工廠，繼續(xù)培養(yǎng)72h；

其中，0-24h內(nèi)培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2、5%O2， 24-48h內(nèi)培養(yǎng)條件為：37℃、5%CO2、20%O2；

48-72h內(nèi)培養(yǎng)條件為：37℃、5%CO2、5%O2；于48h后收集半量誘導培養(yǎng)基，并向細胞工廠中加入等量誘導培養(yǎng)基；72h后收集全部誘導培養(yǎng)基。

2.如權利要求1所述的間充質干細胞因子的大規(guī)模制備方法，其特征在于，所述制備方法還包括間充質干細胞因子的冷凍干燥步驟，將間充質干細胞因子濃縮液用生理鹽水稀釋得到間充質干細胞因子生理鹽水稀釋液，添加凍干保護劑混合均勻，過濾除菌后-80℃冷凍，并進行真空干燥，得到的間充質干細胞因子凍干粉，-20℃保存。

3.如權利要求2所述的間充質干細胞因子大規(guī)模制備方法，其特征在于，所述凍干保護劑包括的組分及各組分在間充質干細胞因子生理鹽水稀釋液中的濃度如下：250-400mmol/L海藻糖、180-220mmol/L山梨醇和0.8-1.3g/L的人血白蛋白。

4.如權利要求3所述的間充質干細胞因子大規(guī)模制備方法，其特征在于，所述凍干保護劑還包括：30-50mmol/L的二氨基乙烷聚丙烯酰胺和12-36mmol/L的黃體酮。

5.如權利要求1所述的間充質干細胞因子大規(guī)模制備方法，其特征在于，間充質干細胞的體外培養(yǎng)包括如下步驟：

（1）將含有間充質干細胞的組織塊，并裝于培養(yǎng)瓶中，加入間充質干細胞無血清培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，保持培養(yǎng)瓶絕對靜止培養(yǎng)5天，其后每3天換液；

（2）待細胞長至75-85%匯合度時，棄間充質干細胞無血清培養(yǎng)基，于非細胞培養(yǎng)面加入生理鹽水洗滌兩次，然后加入0.25%胰酶均勻浸潤細胞貼壁面，室溫孵育3-5min，待細胞變圓后加無血清培養(yǎng)基，快速震蕩并吹打細胞貼壁面，得到細胞懸液，離心棄上清，沉淀加生理鹽水再次洗滌并離心得細胞沉淀，所述細胞沉淀用無血清培養(yǎng)基重懸，細胞篩過濾，計數(shù)并以為1-2×104個/ml細胞濃度鋪瓶，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)；如此反復至細胞傳代至4代；

（3）取經(jīng)傳代培養(yǎng)的第4代間充質干細胞細胞；按1-2×104/ml密度接種于細胞工廠進行擴增培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2、20%O2培養(yǎng)。