[發(fā)明專利]一種微生物低溫保存保護(hù)劑

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201611120538.1
• 申請日: 2016-12-07
• 公開（公告）號(hào): CN106754376B
• 公開（公告）日: 2018-09-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 趙愛華;王國治;付麗麗;寇麗杰
• 申請（專利權(quán)）人: 中國食品藥品檢定研究院
• 主分類號(hào): C12N1/04
• 分類號(hào): C12N1/04;C12R1/32
• 代理公司: 北京知元同創(chuàng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11535
• 代理人: 劉元霞;牛艷玲

本發(fā)明涉及一種微生物低溫保存保護(hù)劑，及其制備方法和用途。微生物低溫保存保護(hù)劑的成分為：非還原性糖、甘油、非離子型表面活性劑、鉀鹽、谷氨酸鹽和水。本發(fā)明還建立了卡介菌低溫長期保存的技術(shù)方法，為深入開展卡介菌的相關(guān)研究提供了技術(shù)支撐。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種微生物低溫保存保護(hù)劑，及其制備方法和用途。

背景技術(shù)

冷凍干燥是一種常用的實(shí)現(xiàn)微生物長保質(zhì)期的方法(CarcobaR，2000)，被廣泛視為是最適合的細(xì)菌脫水過程之一，其目的在于獲得穩(wěn)定的最終試劑(Carvalho AS，2004)，也是用于貯存微生物細(xì)胞培養(yǎng)物的最常見方法之一。冷凍干燥后的細(xì)胞存活率反映了細(xì)胞抵抗快速冷凍和干燥的影響(Miyamoto‐ShinoharaY，2008)。一般認(rèn)為，大多數(shù)無保護(hù)的細(xì)菌在冷凍干燥后都會(huì)被殺死，而存活的那些在進(jìn)行貯存時(shí)迅速死亡。要想獲得理想的冷凍及凍干效果，除工藝外，篩選和使用適宜的冷凍保護(hù)劑也是十分重要的。適宜的凍干保護(hù)劑能夠使微生物在凍干以及解凍的過程中降低死亡率，減輕冷凍干燥以及解凍時(shí)所引起的菌體損傷。因而，凍干保護(hù)劑的種類、濃度和配置方法對微生物的保存效果有明顯的影響。Harrison(1963)推薦凍干保護(hù)劑應(yīng)具有以下條件：1)保護(hù)劑應(yīng)含有能形成骨架的物質(zhì)；2)它應(yīng)含有限制剩余水分的緩沖物質(zhì)；3)電解質(zhì)的含量應(yīng)少等。

已進(jìn)行了多種嘗試來增加凍干和貯存后存活的細(xì)菌的數(shù)量，但僅取得有限的成功。

選擇適當(dāng)?shù)母稍锝橘|(zhì)/冷凍保護(hù)劑混合物是增加微生物尤其是細(xì)菌微生物在凍干和后續(xù)貯存過程中存活率的關(guān)鍵因素(Carvalho AS，2004)。現(xiàn)有技術(shù)中，CN101108164A報(bào)告了卡介菌多糖核酸在凍干中的幾項(xiàng)研究。Castro等人評估了5％的海藻糖對保加利亞乳桿菌(Lactobacillusbulgaricus)在冷凍干燥后存活率的有益效果，相比起在單獨(dú)的水中的約1％的留存率，它們顯示25％的留存率。2003年，Carvalho等人證明了谷氨酸鈉對凍干和3‐6個(gè)月的后續(xù)貯存期間的存活的穩(wěn)定作用，但所報(bào)導(dǎo)的微生物存活率仍然很低。

卡介菌(Bacillus Calmette‐Guérin,BCG)源自具有致病性的牛型結(jié)核桿菌經(jīng)230代次連續(xù)傳代后形成的減毒菌株。我國目前涉及卡介菌的上市或臨床研究中生物制品主要有皮內(nèi)注射用卡介苗、卡介菌多糖核酸注射液(BCG‐PSN)、卡介菌純蛋白衍生物(BCG‐PPD)、治療用卡介苗、卡介菌CpG‐DNA等。這些產(chǎn)品均涉及卡介菌活菌的收獲與應(yīng)用，因此現(xiàn)行版藥典均對其種子批傳代代次有要求，目的是降低細(xì)菌變異的風(fēng)險(xiǎn)。尤其對于活菌制品的菌種傳代代次要求基本為：自工作種子批啟開至菌體收集，傳代應(yīng)不超過12代。然而國內(nèi)卡介苗產(chǎn)品的代次多數(shù)為12代，國外卡介苗制品的代次則多為3‐5代，這種差別的主要原因是菌種首次復(fù)蘇后活菌量少，只能通過增加培養(yǎng)代次來滿足生產(chǎn)需要。解決該問題的首要關(guān)鍵之一是如何提高卡介菌菌種首次復(fù)蘇的活菌含量。正常情況下，接種的活菌含量越多，菌種復(fù)蘇所需的時(shí)間越短，形成的菌苔或菌膜的質(zhì)量越高，反之，活菌含量越低，所需要的復(fù)蘇時(shí)間就越長，進(jìn)一步影響后續(xù)的傳代與收獲。卡介苗菌種所含的活菌數(shù)量與菌種的保存形式有關(guān)。菌種的保存形式有兩種，一種為凍干保存，一種為液體冷凍保存。凍干菌種為卡介菌培養(yǎng)物加凍干保護(hù)劑后經(jīng)過低溫冷凍真空干燥制備而成，凍干后活菌較穩(wěn)定，可在2‐8℃保藏與運(yùn)輸，在室溫下也能保持相對穩(wěn)定；但凍干后菌種活菌含量下降，平均僅為凍干前液體菌種的16％‐20％左右，且菌株經(jīng)干燥后復(fù)蘇時(shí)間也較長。菌種的另一種保存方式為液體冷凍保存菌種，即卡介菌新鮮培養(yǎng)物加低溫保存保護(hù)劑后，在‐20℃及以下溫度冷藏，該方式具有保持活菌含量高容易復(fù)蘇的特點(diǎn)。

目前，現(xiàn)有技術(shù)中對卡介菌的研究中，多針對卡介菌多糖核酸的保存進(jìn)行研究，而對卡介菌活菌的菌種保存研究較少，同時(shí)，在菌種的保存中，基本都是采用凍干保存，存在凍干菌種復(fù)蘇慢、保存效率不高等問題。