[發明專利]一種用于篩選MdmX抑制劑或測試MdmX抑制劑的抑制活性的融合蛋白

有效

• 申請號: 201611119574.6
• 申請日: 2016-12-07
• 公開（公告）號: CN106699897B
• 公開（公告）日: 2020-10-20
• 發明（設計）人: 蘇正定;陳蓉;成細瑤
• 申請（專利權）人: 湖北工業大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/70
• 代理公司: 北京輕創知識產權代理有限公司 11212
• 代理人: 談杰

本發明公開了一種用于篩選MdmX抑制劑或測試MdmX抑制劑的抑制活性的融合蛋白，包括測試序列、結合序列和連接臂序列；其中測試序列為MdmX序列或包含MdmX序列中的p53結合結構域的MdmX片段；結合序列為p53序列或包含p53序列中的MdmX結合結構域的p53片段；連接臂序列為一個肽段，其上下游分別與所述測試序列和所述結合序列之一連接，其氨基酸序列不參與融合蛋白的二級結構的形成，其長度和柔性足以使所述測試序列的空間結構的任一表面部分與所述結合序列的空間結構的任一表面部分在空間上有機會相接觸。當MdmX抑制劑競爭性結合了結合序列中的p53結合結構域后，釋放的結合序列中的色氨酸完全暴露于水相，兩種狀態下的色氨酸發射光譜不同，可以由此有效地測定MdmX抑制劑對MdmX的抑制程度。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及一種用于篩選MdmX抑制劑或測試Mdmx抑制劑的抑制活性的重組蛋白的制備和應用，更具體涉及一種p53多肽和MdmX氨基端融合蛋白及其類似物的制備及其在篩選MdmX抑制劑或測試MdmX抑制劑的抑制活性中的應用。

背景技術

p53是一種抑癌蛋白，在細胞周期阻滯、DNA損傷修復及細胞凋亡等生物過程中發揮作用，并已成為重要的腫瘤治療靶點。p53的抑制癌變活性受到細胞內過表達MdmX和Mdm2的抑制，與過半數的癌癥相關。解除MdmX和Mdm2對p53的抑制是開發新型癌癥治療藥物的靶點。

MdmX和Mdm2是p53下游的重要調控基因蛋白，MdmX和Mdm2為同源蛋白，兩者結構高度相似，但抑制p53的機理有所不同。目前Mdm2抑制劑的篩選和設計較為成熟，許多已經進入臨床研究階段，例如nutlin-3a改進型分子RG7112即將進入II期臨床研究(Ray-CoquardI,Blay J Y,Italiano A,et al.Effect of the MDM2antagonist RG7112on theP53pathway in patients with MDM2-amplified,well-differentiated ordedifferentiated liposarcoma:an exploratory proof-of-mechanism study[J].Thelancet oncology,2012,13(11):1133-1140)。但是，MdmX抑制劑的有效篩選和設計進展緩慢。由于Mdm2抑制劑的抗藥性問題(Lane D P,Cheok C F,Lain S.p53-based cancertherapy[J].Cold Spring Harbor perspectives in biology,2010,2(9):a001222.)，癌細胞中的MdmX會進一步過表達，加劇癌細胞的惡化。因此，尋找MdmX抑制劑，及以MdmX為基礎而設計的MdmX/Mdm2雙抑制劑是治療近半數癌癥的有效藥物。

MdmX的N末端存在p53的結合域，MdmX的p53結合域可以和p53蛋白的轉錄激活結構域結合，形成p53/MdmX復合體，該復合體能夠抑制p53的轉錄活性，但并不介導p53的降解，使p53蛋白失活而誘發腫瘤。

如若一種化合物，能和p53-MdmX復合物競爭性結合，釋放p53的轉錄活性，或以競爭性或不可逆性結合游離的MdmX，則這種化合物可以解除或部分解除MdmX對p53的抑制，使得p53發揮抑癌的作用，因此，這種化合物可視為癌癥的治療或緩解用的藥物。

現有技術中公開了一些通過與p53競爭性結合MdmX而測試MdmX抑制劑的技術方案。

中國專利文獻CN105936646(公開日：2016.09.14)公開了一類迷你蛋白及其應用。所述迷你蛋白以白蛋白結合域的3α螺旋束為骨架蛋白，并且在所述骨架蛋白的三維結構表面、N端、C端中的至少一處引入有陽離子性氨基酸，并經所述陽離子性氨基酸至少連接p53與MDM2/MDMX結合的關鍵氨基酸位點。該迷你蛋白兼具入胞以及與白蛋白、MDM2/MDMX結合的能力，并可良好抑制p53和Mdm2/MdmX之間的相互作用，可用于制備抗癌藥物等，可用于規模化生產和應用。小蛋白與Mdm2/MdmX的結合用的熒光偏振檢測。