[發(fā)明專利]可同時(shí)檢測單核增生李斯桿菌、金黃色葡萄球菌和屎腸球菌的多重PCR檢測方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201611116199.X
• 申請(qǐng)日: 2016-12-07
• 公開（公告）號(hào): CN106636382B
• 公開（公告）日: 2020-10-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉昆;宋越;劉威;張?jiān)旅?/a>;裴樂;陳偉;趙世華
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院
• 主分類號(hào): C12Q1/689
• 分類號(hào): C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/14;C12Q1/04;C12N15/11
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本發(fā)明根據(jù)單核細(xì)胞增多性李斯桿菌的hlyA基因，金黃色葡萄球菌的NUC基因與屎腸球菌的ddl基因分別設(shè)計(jì)引物，建立了能夠同時(shí)檢測這三種病原菌的多重PCR方法。該方法能夠特異性的擴(kuò)增單核細(xì)胞增多性李斯桿菌，金黃色葡萄球菌和屎腸球菌DNA片段，其最低檢測量分別為、1.07pg、11.6pg和1.21pg。該方法對(duì)其他常見的致病菌無交叉反應(yīng)。本發(fā)明所建立的多重PCR反應(yīng)具有特異性強(qiáng)、敏感性高的特點(diǎn)，為臨床上單核細(xì)胞增多性李斯桿菌、金黃色葡萄球菌和屎腸球菌的快速檢測，鑒定以及流行病學(xué)調(diào)查提供了方便、快捷、準(zhǔn)確的方法。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種多重PCR檢測方法，尤其是一種耗時(shí)短、效率高、靈敏度高，可直接應(yīng)用于同時(shí)檢測單核細(xì)胞增多性李斯桿菌、金黃色葡萄球菌與屎腸球菌的多重PCR檢測方法。

背景技術(shù)

單核細(xì)胞增多性李斯桿菌病為人畜共患病，可引起皮膚感染、胃腸道紊亂，敗血癥。單核細(xì)胞增多性李斯桿菌主要是通過腸道感染，從腸道進(jìn)入后第一侵害的靶器官是肝。在肝中單核細(xì)胞增多性李斯桿菌能大量繁殖，直到機(jī)體細(xì)胞免疫反應(yīng)增強(qiáng)后才停止。單核細(xì)胞增多性李斯桿菌與結(jié)核菌、弓形蟲蟲體類似可以降低動(dòng)物母體的細(xì)胞免疫的機(jī)能，從而使動(dòng)物孕期母體出現(xiàn)免疫缺陷而導(dǎo)致懷孕動(dòng)物或人出現(xiàn)早產(chǎn)流產(chǎn)現(xiàn)象、損害神經(jīng)系統(tǒng)(腦炎、腦膜炎)。感染單增性李氏桿菌動(dòng)物的死亡率高達(dá)7％以上。

金黃色葡萄球菌同樣為人畜共患病，不僅為患病動(dòng)物攜帶該菌，在健康動(dòng)物的體內(nèi)也可分離到具有致病毒素的菌株。金黃色葡萄球菌可導(dǎo)致動(dòng)物組織部位化膿，也能引起動(dòng)物產(chǎn)生肺炎等疾病。由于該細(xì)菌感染的動(dòng)物在產(chǎn)生敗血癥后還會(huì)繼發(fā)性的引起腦膜炎，尤其多見于合并左心內(nèi)膜炎的患者，通過細(xì)菌栓子經(jīng)血流侵襲腦膜。

腸球菌可引起人和動(dòng)物感染，且屎腸球菌的感染率呈逐年上升趨勢。腸球菌本身具有較強(qiáng)的耐藥性，不易治愈，此病原菌已受到獸醫(yī)臨床工作者的重視。且單核細(xì)胞增多性李斯桿菌，金黃色葡萄球菌與屎腸球菌均可引起動(dòng)物腦炎。

在內(nèi)蒙古中部地區(qū)一些羊場發(fā)生的以腦炎癥狀為主的感染病例中，分離得到腦源性金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增多性李斯桿菌與屎腸球菌臨床分離株。臨床中單核細(xì)胞增多性李斯桿菌引起的動(dòng)物腦炎病例較為常見，但由金黃色葡萄球菌、屎腸球菌引起動(dòng)物腦炎病例較為少見。到目前為止，獸醫(yī)臨床對(duì)該病的診斷主要依靠病原的分離、鑒定，但是由于病原種類較為復(fù)雜，特別是李斯桿菌屬的細(xì)菌種類較多，鑒定存在步驟繁瑣、時(shí)間長等缺點(diǎn)，并且對(duì)單核細(xì)胞增多性李斯桿菌的分菌、試驗(yàn)具有較高的風(fēng)險(xiǎn)性，因此，建立快速、特異的PCR診斷方法對(duì)于該病的早期確診和治療具有重要的臨床價(jià)值。

目前，國內(nèi)外針對(duì)這三種菌建立的多重PCR檢測方法尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)根據(jù)單核細(xì)胞增多性李斯桿菌Hyl基因與金黃色葡萄球菌NUC基因、屎腸球菌ddl基因序列設(shè)計(jì)其特異性引物，建立鑒別檢測的多重PCR方法，為開展由金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增多性李斯桿菌、屎腸球菌單一或混合感染性腦炎的快速鑒別診斷提供新的方法。

本發(fā)明根據(jù)三種菌株的特異性基因設(shè)計(jì)引物，能夠在多重或單一感染的病料中同時(shí)檢測到這三種或鑒別其中單一病原，從而為本地區(qū)提供了一種可以快速診斷由此三種病原菌多重或單一感染的多重PCR檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有技術(shù)所存在上述問題，提供一種耗時(shí)短、效率高、靈敏度高，可直接應(yīng)用于同時(shí)檢測單核細(xì)胞增多性李斯桿菌、金黃色葡萄球菌與屎腸球菌的多重PCR檢測方法。

本發(fā)明根據(jù)單核細(xì)胞增多性李斯桿菌Hyl基因、屎腸球菌ddl基因、金黃色葡萄球菌NUC基因，分別設(shè)計(jì)了1對(duì)特異性引物，在確定引物最佳濃度等反應(yīng)體系的條件下，進(jìn)一步確定了多重PCR擴(kuò)增程序，由此建立了能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)單核細(xì)胞增多性李斯桿菌鑒定、金黃色葡萄球菌、屎腸球菌同時(shí)檢測或單一鑒別的多重PCR方法。

本發(fā)明提供用于同時(shí)檢測單核細(xì)胞增多性李斯桿菌、金黃色葡萄球菌與屎腸球菌的多重PCR引物，引物針擴(kuò)增的基因分別為單增性李斯桿菌Hyl基因、屎腸球菌ddl基因、金黃色葡萄球菌NUC基因，其特征如下：