[發(fā)明專利]一種鑒定和篩選高兒茶素指數(shù)茶樹的功能標(biāo)記及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201611115275.5
• 申請(qǐng)日: 2016-12-07
• 公開（公告）號(hào): CN107164459A
• 公開（公告）日: 2017-09-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 金基強(qiáng);陳亮;姚明哲;馬建強(qiáng);馬春雷
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 杭州浙科專利事務(wù)所(普通合伙)33213
• 代理人: 沈淵琪

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種茶樹類黃酮3′,5′?羥化酶基因功能標(biāo)記，該功能標(biāo)記的上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物如SEQ ID No.2所示。本發(fā)明還提供茶樹類黃酮3′,5′?羥化酶基因功能標(biāo)記在鑒定和篩選具有高兒茶素指數(shù)茶樹中的應(yīng)用以及應(yīng)用方法。本發(fā)明中的功能標(biāo)記運(yùn)用于分子標(biāo)記輔助選擇，能快速準(zhǔn)確地鑒定和篩選出具有高兒茶素指數(shù)（CI值2.5）的茶樹資源。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種鑒定和篩選高兒茶素指數(shù)茶樹的功能標(biāo)記及其應(yīng)用、應(yīng)用方法。

背景技術(shù)

兒茶素是2-苯基苯并吡喃的衍生物，根據(jù)兒茶素B環(huán)的羥基數(shù)目、C環(huán)上2,3位同分異構(gòu)體、C環(huán)上3位是否連接沒食子酸等可以劃分為若干種組分。根據(jù)兒茶素B 環(huán)的羥基數(shù)目，兒茶素主要可以分為B環(huán)二羥基兒茶素和三羥基兒茶素，其中表沒食子兒茶素(EGC) 和表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG) 屬于B 環(huán)三羥基兒茶素，而表兒茶素(EC) 和表兒茶素沒食子酸酯(ECG) 屬于B環(huán)二羥基兒茶素。在紅茶發(fā)酵過程中，每個(gè)茶黃素分子的形成需要1個(gè)二羥基兒茶素和1個(gè)三羥基兒茶素，即兒茶素指數(shù)CI（即二羥基兒茶素/三羥基兒茶素）值為1的鮮葉原料最有利于茶黃素的形成。國外已有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，兒茶素指數(shù)CI值與紅茶品質(zhì)密切相關(guān)。

但專利申請(qǐng)人研究發(fā)現(xiàn)，與肯尼亞等優(yōu)質(zhì)紅茶主產(chǎn)國家相比，我國不乏有高兒茶素資源，但這些資源所含的兒茶素EGCG占比偏大（約60%），CI值多在0.2-0.5（Jin et al.,2014）。近期，在貴州的少量茶樹資源中，發(fā)現(xiàn)了CI值高達(dá)5的茶樹。利用高兒茶素指數(shù)的資源與其它高兒茶素總量的資源進(jìn)行雜交，有望培育出兒茶素總量高、兒茶素組分比例合適的優(yōu)質(zhì)紅茶品種，高兒茶素指數(shù)茶樹資源對(duì)改良我國茶樹品種有較大的潛在應(yīng)用價(jià)值。但迄今為止，國內(nèi)外茶葉兒茶素含量的鑒定大都采取生化測(cè)定方法，該方法受茶樹發(fā)育時(shí)期和生存環(huán)境影響、且需要一定量的茶樹葉片，無法做到對(duì)野外資源的準(zhǔn)確鑒定和雜交子代個(gè)體的早期鑒定。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于設(shè)計(jì)提供一種基于茶樹類黃酮3′,5′-羥化酶基因上游調(diào)控區(qū)域序列存在的插入缺失（InDel）突變開發(fā)的分子標(biāo)記，及其應(yīng)用在鑒定和篩選高兒茶素指數(shù)茶樹中的技術(shù)方案。高兒茶素指數(shù)茶樹指的是CI值大于2.5的特異茶樹材料。

所述的一種茶樹類黃酮3′,5′-羥化酶基因功能標(biāo)記，其特征在于該功能標(biāo)記的上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物如SEQ ID No.2所示。

所述的一種茶樹類黃酮3′,5′-羥化酶基因功能標(biāo)記在鑒定和篩選具有高兒茶素指數(shù)茶樹中的應(yīng)用，其特征在于該功能標(biāo)記的上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物如SEQ ID No.2所示,所述的高兒茶素指數(shù)茶樹指的是CI值大于2.5的特異茶樹材料。

所述的一種茶樹類黃酮3′,5′-羥化酶基因功能標(biāo)記在鑒定和篩選具有高兒茶素指數(shù)茶樹中的應(yīng)用方法，其特征在于包括以下步驟：

利用功能標(biāo)記對(duì)各茶樹材料中的F3′5′H基因起始密碼子ATG上游837bp至上游686bp的DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠分析，如擴(kuò)增產(chǎn)物顯示為152bp的片段則該茶樹確定為常規(guī)資源，如擴(kuò)增產(chǎn)物顯示為138bp的片段則該茶樹確定為高兒茶素指數(shù)茶樹。

所述的應(yīng)用方法，其特征在于所述的PCR擴(kuò)增的體系和反應(yīng)程序?yàn)椋篜CR反應(yīng)體系：32 μL ddH₂O，2 μL DNA，5 μL 10×PCR Buffer，4 μL 25 mM MgCl₂，5 μL 2 Mm dNTP，1μLKOD-Plus-Neo酶，10 μM 的上、下游引物各3 μL；PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃ 2 min，然后進(jìn)行以下循環(huán)，94℃ 15 sec，56℃ 25 sec，68℃ 5 sec，共 35個(gè)循環(huán)；最后68℃延伸2min；擴(kuò)增產(chǎn)物在3%的瓊脂糖膠電泳分離。