[發明專利]肺炎鏈球菌超快速核酸檢測方法

在審

• 申請號: 201611112288.7
• 申請日: 2016-12-07
• 公開（公告）號: CN108165612A
• 公開（公告）日: 2018-06-15
• 發明（設計）人: 馮長訪
• 申請（專利權）人: 美科生物醫學技術無錫有限公司
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12Q1/689;C12Q1/14;C12R1/46
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明涉及一種肺炎鏈球菌超快速實時核酸檢測方法，通過提取核酸，在特殊的緩沖液和圓盤式反應容器中用熒光標記引物在酶催化下進行擴增并實時定量檢測標本中核酸模板的含量。特殊的緩沖液和圓盤式反應容器使本方法的反應時間比以往的熒光定量核酸檢測方法的反應時間大大的縮短了，由原來的1小時以上縮短到現在的5?10分鐘，真正實現了肺炎鏈球菌感染的快速檢測。具有反應時間短，操作簡單，特異性高，尤其適合用于突發性急性肺炎鏈球菌感染的檢測，有很高的推廣價值。

技術領域

本發明涉及一種核酸檢測方法，具體涉及一種肺炎鏈球菌的超快速核酸實時熒光定量檢測方法。可用于肺炎鏈球菌的核酸定量檢測，尤其適合用于肺炎鏈球菌感染的快速檢測。

背景技術

1985年，美國PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Mullis等人發明了具有劃時代意義的聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)，使得人們可以在體外有目的地無限擴增特定的核酸片段。其原理類似于DNA的體內復制，只是在離心管中給DNA的體外合成提供一種合適條件。經過多年的發展，這一技術已經非常成熟，現在已是分子生物學研究和臨床診斷領域中最重要和最常用的技術。PCR儀的出現則使該技術實現了自動化，使得PCR的技術應用更加廣泛，例如在診斷遺傳性疾患、檢測臨床標本中病原體的核酸、對法醫標本作遺傳學鑒定，以及分析激活癌基因中的突變情況等方面都得到了廣泛的應用。與其同時，針對不用的應用領域，核酸檢測技術也發展為很多種類型，其中依賴核酸序列的擴增和環介導等溫擴增方法應用也較廣泛。但是，核酸檢測技術還面臨著許多挑戰，現有的核酸檢測技術中整個擴增時間長達一個多小時、擴增過程也比較復雜，結果不容易重復，尤其是在突發性傳染病的檢測方面受到了限制。

提高實時熒光定量核酸檢測的反應速度，縮短整個檢測時間，使其更方便地應用于臨床檢測，特別是突發性傳染病的檢測，為疾病的治療和控制贏取寶貴的時間，則是核酸檢測技術未來的一個重要發展方向。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的缺點，提供一種反應時間大幅度縮短、操作簡單的超快速實時熒光定量核酸檢測方法，可普遍用于多種類型標本中肺炎鏈球菌核酸的分析及臨床檢測。

本發明所涉及的肺炎鏈球菌超快速實時熒光定量核酸檢測方法，其特征在于：提取核酸，在特殊的緩沖液和圓盤式反應容器中用熒光標記引物在酶催化下進行擴增并實時定量檢測標本中肺炎鏈球菌核酸模板的含量。該檢測方法通過以下技術方案實現：(1)核酸模板提取：A、樣品處理；B、核酸分離；C、核酸沉淀；D、核酸洗滌；E、核酸溶解；F、核酸濃度測定；G、核酸電泳檢測。(2)加樣：將模板、引物、酶、特殊緩沖液等加入到圓盤式反應容器。(3)熒光定量核酸檢測：以特異性引物進行實時熒光PCR定量檢測標本中核酸的含量。

所述的特殊緩沖液含有1-100mg/L的甜菜堿作為擴增速度促進劑。所述的圓盤式反應容器為刻有凹槽的圓盤，圓盤直徑為1-30厘米，厚度為0.1-3毫米，圓盤上的凹槽數目為1-200個，加樣的容積為1-100微升，比起以往的離心管則加熱面積更大，熱傳導效率更高。特殊的緩沖液和圓盤式反應容器使本方法的反應時間比以往的熒光定量核酸檢測方法的反應時間大大的縮短了，由原來的1小時以上縮短到現在的5-10分鐘，真正實現了肺炎鏈球菌感染的快速檢測。

該技術有以下優點：反應速度超快，反應時間超短，由傳統的1個半小時反應時間縮短到5-10分鐘，極大地提高了檢測效率，贏得了寶貴的治療時間；高度特異性，特異的引物確保反應不受其它因素的干擾，對序列高度同源的序列也可精確區分；超寬的定量線性范圍和高度的檢測靈敏度，從幾個拷貝到幾萬個拷貝，定量線性范圍跨越7個數量級。

綜上所述，本發明所涉及的肺炎鏈球菌核酸檢測技術操作簡單，反應時間短，特異性高，尤其適合用于突發性急性肺炎鏈球菌感染的檢測，有很高的推廣價值。

附圖說明

圖1為實施例1的核酸電泳結果；