[發明專利]一種定向快速篩選產膽鹽水解酶植物乳桿菌的方法

在審

• 申請號: 201611111579.4
• 申請日: 2016-12-06
• 公開（公告）號: CN108148773A
• 公開（公告）日: 2018-06-12
• 發明（設計）人: 丁軻;陳亞茹;劉煒;余祖華;李旺;李元曉;何萬領;曹平華;趙龍妹;王玉琴;張春杰;程相朝
• 申請（專利權）人: 河南科技大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12R1/25
• 代理公司: 鄭州睿信知識產權代理有限公司 41119
• 代理人: 胡云飛

1.一種定向快速篩選產膽鹽水解酶植物乳桿菌的方法，其特征在于：包括以下步驟：

1)以樣品宏基因組DNA為模板，利用引物對BSH_L/BSH_R進行PCR擴增，篩選出具有BSH基因的樣品；

2)以上述樣品為分離對象，純化得到疑似植物乳桿菌的菌株；

3)以菌株基因組DNA為模板，利用引物對BSH_L/BSH_R進行PCR擴增，篩選得到具有BSH基因的疑似植物乳桿菌菌株；

4)取上述菌株進行分子鑒定，篩選得到產膽鹽水解酶的植物乳桿菌；

步驟1)、3)中引物對BSH_L/BSH_R為：

BSH_L：5’-AACTGCAGATGTGTGTACTGCCATAACT-3’；

BSH_R：5’-GGAATTCTTAGTTAACTGCATAGTATTGTG-3’。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟1)、3)中PCR擴增的反應體系為：10×PCR buffer 2.5μL，25mmol/L dNTPs 2.0μL，5U/μL DNA Polymerase 0.5μL，20pmol/L引物BSH_L、BSH_R各0.5μL，75mg/L模板0.5μL，超純水18.5，總計25.0μL。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于：PCR擴增的反應程序為：95℃預變性5min，95℃變性30s，54℃退火45s，72℃延伸90s，30個循環后，72℃延伸10min。

4.根據權利要求1～3中任一項所述的方法，其特征在于：步驟1)、3)中PCR擴增得到990bp的基因片段，即為具有BSH基因。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟2)中純化采用含牛磺膽酸鈉的MRS培養基，組成為：蛋白胨1g、牛肉膏0.5g、酵母浸粉0.5g、吐溫-80 0.1mL、葡萄糖2.0g、磷酸氫二鉀0.2g、檸檬酸二銨0.2g、乙酸鈉0.5g、硫酸鎂0.058g、硫酸錳0.025g，牛磺膽酸鈉0.3g，膽固醇10mg，瓊脂1.5g，蒸餾水定容至100mL。

6.根據權利要求1或5所述的方法，其特征在于：在純化前，先將分離對象接種于含牛磺膽酸鈉的MRS液體培養基中富集，于35～40℃下厭氧培養20～28h；含牛磺膽酸鈉的MRS液體培養基的組成為：蛋白胨1g、牛肉膏0.5g、酵母浸粉0.5g、吐溫-80 0.1mL、葡萄糖2.0g、磷酸氫二鉀0.2g、檸檬酸二銨0.2g、乙酸鈉0.5g、硫酸鎂0.058g、硫酸錳0.025g，牛磺膽酸鈉0.3g、膽固醇10mg，蒸餾水定容至100mL。

7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟4)中分子鑒定為：利用引物對P1/P2進行PCR擴增，鑒定確認菌株的16S rDNA片段，引物如下：

P1：5’-AACTGAAGAGTTTGATCCTGGCTC-3’；

P2：5’-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’。

8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于：所述擴增的反應體系為：10×PCRbuffer2.5μL，25mmol/L dNTPs 2.0μL，5U/μL DNA Polymerase 0.5μL，20pmol/L引物P1、P2各0.5μL，75mg/L菌株全基因組DNA 0.5μL，超純水18.5μL，總計25.0μL。

9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于：擴增的反應程序為：95℃預變性5min，95℃變性30s，53℃退火45s，72℃延伸90s，30個循環后，72℃延伸10min。

10.根據權利要求1、7～9中任一項所述的方法，其特征在于：在分子鑒定前，先對疑似植物乳桿菌的菌株進行降膽固醇能力評定，評定方法為：將菌株接種于含牛磺膽酸鈉的MRS液體培養基中，35～40℃下厭氧培養，檢測菌液中膽固醇殘余量，計算膽固醇降解率。