[發(fā)明專利]西伯利亞杏體細胞胚胎發(fā)生的方法

有效

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• 申請日: 2016-12-06
• 公開（公告）號: CN106718893B
• 公開（公告）日: 2018-09-14
• 發(fā)明（設計）人: 白玉娥;何炎紅;葉冬梅;田有亮;林濤;桑斯爾珠拉;娜蘇勒瑪;烏云塔娜
• 申請（專利權）人: 內蒙古農業(yè)大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 上海申蒙商標專利代理有限公司 31214
• 代理人: 周豐

本發(fā)明為一種西伯利亞杏體細胞胚胎發(fā)生的方法，屬于植物栽培領域種苗技術，具體的講是利用西伯利亞杏成熟胚誘導體細胞胚胎發(fā)生的方法。本發(fā)明采用完全成熟的西伯利亞杏種子，取成熟胚為外植體材料，接種到愈傷誘導培養(yǎng)基上培養(yǎng)，誘導產生胚性愈傷，將上述愈傷增殖從而能達到擴繁目的，再由胚性愈傷進行進一步誘導,使其分化形成上期原胚，由早期原胚在一定條件下同步化培養(yǎng)，促使其發(fā)育同步化，已同步化培養(yǎng)的早期原胚進一步成熟，形成具備可正常萌發(fā)條件的體細胞胚：本發(fā)明的優(yōu)點是，采用本發(fā)明獲得了大量的西伯利亞杏體細胞胚，實現(xiàn)西伯利亞杏優(yōu)良品種的快速繁殖。

技術領域

本發(fā)明屬于植物栽培領域，具體的講，涉及西伯利亞杏體細胞胚胎發(fā)生的一種方法。

背景技術

西伯利亞杏（Armeniaca sibirica (L.) Lam）主要分布于我國北方地區(qū)，是我國北方地區(qū)的主要經(jīng)濟樹種和生態(tài)綠化樹種，具有廣泛應用和實際價值。西伯利亞杏繁殖常用方法主要是播種繁殖和嫁接方法,嫁接方法繁殖能夠保持品種的優(yōu)良特性,遺傳性狀穩(wěn)定,但通過嫁接繁殖速度慢,嚴重阻礙了優(yōu)良品種在大批量生產的推廣應用。播種繁殖需要通過層積等技術，種子處理時間長，要求高，且由于種子產量往往受到氣候影響，限制了西伯利亞杏播種苗培養(yǎng)。利用植物體細胞胚胎發(fā)生方式能用較少的材料,在較短時間內大量繁殖出統(tǒng)一優(yōu)良性狀的西伯利亞杏苗木。應用體胚發(fā)生技術繁殖苗木,其不受地區(qū)、氣候等影響,擴繁速度比常規(guī)方法快數(shù)萬倍，廣泛應用到多種植物上。但迄今為止,西伯利亞杏組培苗在生產尚未應用，對西伯利亞杏體胚發(fā)生的研究未見報道。王鴻、馬鋒旺以西伯利亞杏下胚軸、子葉、莖尖和無性系葉片作為外植體,研究培養(yǎng)試管苗不同外植體、外源植物生長調節(jié)劑、培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)時間、接種方式等因素對增殖效率、愈傷組織誘導率、再生頻率和試管苗生根的影響。劉小蕾、劉艷萌、張學英等通過對西伯利亞杏的莖尖、葉片和下胚軸組織培養(yǎng)初步建立了西伯利亞杏再生體系。本文以西伯利亞杏成熟胚為外植體，經(jīng)愈傷組織途徑誘導胚性愈傷、胚性愈傷組織繼代增殖、體細胞胚胎的分化與同步化，以及體細胞胚的成熟與萌發(fā)，從而建立西伯利亞杏體胚發(fā)生體系，為西伯利亞杏快速繁殖、種質資源保護等提供參考，為西伯利亞杏人工種子的開發(fā)應用奠定基礎。

發(fā)明內容

本發(fā)明目的為了解決運用體細胞胚胎發(fā)生技術實現(xiàn)西伯利亞杏快繁問題，以西伯利亞杏成熟胚為外植體，以B5、WPM等基本培養(yǎng)基附加不同濃度的6-BA、2,4-D、KT、NAA、ABA以及有機附加物等來誘導胚性愈傷組織、胚性愈傷組織增殖、體細胞胚胎分化與同步化、以及體胚成熟與植株再生，并提供一種誘導、繼代及成苗時的方法及培養(yǎng)條件，以實現(xiàn)植株再生與快繁。

本發(fā)明目的實現(xiàn)由以下技術方案完成：

本發(fā)明包括以下生產步驟：

（1）將成熟的西伯利亞杏種子用刷子刷去表面殘渣，以3%高錳酸鉀溶液浸泡12小時后，自來水沖洗3遍，在干凈的環(huán)境下破殼，取出西伯利亞杏種仁。在超凈工作臺中，先用無菌水將種仁沖洗三遍，用75%酒精浸泡30s后用無菌水清洗3-5次,再用 2%次氯酸鈉溶液消毒3 min,然后用無菌水沖洗3-5次；

（2）將經(jīng)步驟（1）處理過的種子以手術刀剝取完整的種胚后，接種于下列培養(yǎng)基中：B5培養(yǎng)基+6-BA（0.3mg/L）+2,4-D（0.9mg/L）+KT（0.25mg/L）+蔗糖（30g/L）+瓊脂（6g/L），pH控制在5.8～6.0、溫度為23±2℃、暗條件下進行誘導培養(yǎng)35天生成愈傷組織；

（3）將步驟（2）所述的愈傷組織接種于以下培養(yǎng)基中：B5培養(yǎng)基+NAA（0.5mg/L）+KT（0.2mg/L）+蔗糖（20g/L）+ 還原型谷胱甘肽（100mg/L）+瓊脂（6g/L），pH控制在5.8～6.0、溫度為23±2℃、暗條件下進行繼代培養(yǎng)30天誘導產生胚性愈傷組織；