[發明專利]鑒別紫黑色條紋果皮番茄的CAPS分子標記方法及應用

有效

• 申請號: 201611104580.4
• 申請日: 2016-12-05
• 公開（公告）號: CN106755357B
• 公開（公告）日: 2020-08-07
• 發明（設計）人: 趙統敏;余文貴;王銀磊;羅志丹;趙麗萍;周蓉
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6858
• 代理公司: 南京縱橫知識產權代理有限公司 32224
• 代理人: 曹征貴

1.鑒別紫黑色條紋果皮番茄的CAPS分子標記方法，其特征在于：所述紫黑色條紋果皮番茄所攜帶的分子標記序列位于3號染色體上，為SEQ ID No.1的核苷酸堿基序列，所述紫黑色條紋果皮番茄基因組DNA模板經PCR擴增，其中紫黑色條紋果皮番茄的擴增引物為SEQID No.3-4的核苷酸堿基序列，所述SEQ ID No.3-4的核苷酸堿基序列為人工設計，擴增產物經限制性內酶酶切，所述限制性內切酶為Lightning^TM NheI限制性內切酶，經酶切后可獲得區別于其他番茄果皮顏色的特異譜帶，所述紫黑色條紋果皮番茄特異性譜帶為一條613bp，所述CAPS標記方法包括如下步驟：

(1)以紫黑色條紋果皮番茄為母本，綠色番茄為父本進行雜交，其中所述綠色番茄攜帶的分子標記序列為SEQ ID No.2的核苷酸堿基序列，兩者雜交獲得F1代，所述F1代果實發育到紅熟期時果皮性狀全為綠色；

(2)將上述步驟(1)中獲得的F1代進行自交，獲得F2代，所述F2代果實發育到紅熟期時果皮性狀出現性狀分離；

(3)采集親本、F1代、F2代中成熟的果皮顏色不同的番茄植株葉片，使用CTAB法提取基因組DNA，以提取的基因組DNA為模板，以人工合成的堿基序列SEQ ID No.3-4為引物，進行PCR擴增；

(4)提取將上述步驟(3)中的PCR擴增產物10μl，在1％瓊脂糖凝膠上電泳檢測擴增結果；確認無誤后，使用膠回收試劑盒回收PCR擴增產物，保存于4℃備用；

(5)將上述步驟(4)中獲得的不同個體基因組DNA的PCR擴增產物，分別使用Lightning^TMNheI快速限制性內切酶進行酶切；

(6)將上述步驟(5)酶切后的產物在1％瓊脂糖凝膠上檢測酶切結果，所述凝膠電泳反應條件為85V/100mA電泳20分鐘；

其中，純合的紫黑色條紋果皮番茄DNA擴增產物無法被Lightning^TM NheI酶切，表現為1條長度為613bp的條帶，純合的綠色番茄的DNA擴增產物完全被Lightning^TM NheI酶切，表現為2條長度分別為390bp和223bp的條帶；雜合的F1代僅有1條染色體DNA的擴增產物可以被Lightning^TM NheI酶切，表現為3條長度分別為613bp、390bp和223bp的條帶；

所述紫黑色條紋果皮番茄F2代為隱性純合基因型，無法被Lightning^TM NheI酶切，表現為1條長度為613bp的條帶，綠色番茄的F2代為顯性純合或雜合，可以完全或部分被Lightning^TM NheI酶切，表現為2條長度分別為390bp和223bp的條帶，或3條長度分別為613bp、390bp和223bp的條帶，橙色果皮等其他顏色過渡性狀F2代也可能為雜合或隱性純合，可以部分或完全被Lightning^TM NheI酶切，表現為3條長度分別為613bp、390bp和223bp的條帶，或2條長度分別為390bp和223bp的條帶。

2.根據權利要求1所述的鑒別紫黑色條紋果皮番茄的CAPS分子標記方法，其特征在于：所述PCR擴增體系總體積為50 μl，其中：模板DNA 5 μl，5 U/μl Taq-Plus DNA聚合酶0.5 μl，含Mg²⁺ 的10× PCR Buffer for Taq5 μl，dNTPs mixture 4 μl，10 μM的正向引物和反向引物各1 μl，ddH₂O 33.5 μl；所述PCR反應程序為：94℃預變性2分鐘；94℃變性30秒，54℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，35個循環；72℃再延伸5分鐘。

3.根據權利要求1所述的鑒別紫黑色條紋果皮番茄的CAPS分子標記方法，其特征在于：所述酶切反應體系為：底物DNA 10 μl，10× CutOne^TM Buffer 3 μl，Lightning^TM NheI 1μl，ddH₂O 16 μl；酶切條件為37℃孵育15分鐘，隨即80℃孵育20分鐘使限制酶失活，停止反應。

4.如權利要求1所述的鑒別紫黑色條紋果皮番茄的CAPS分子標記方法的應用，其特征在于：所述分子標記方法在番茄品種改良以及育種中的應用。