[發明專利]一種生長激素受體激活劑的制備方法

在審

• 申請號: 201611104556.0
• 申請日: 2016-12-05
• 公開（公告）號: CN107383194A
• 公開（公告）日: 2017-11-24
• 發明（設計）人: 張俊
• 申請（專利權）人: 陜西易陽科技有限公司
• 主分類號: C07K16/28
• 分類號: C07K16/28;C07K14/47
• 代理公司: 西安億諾專利代理有限公司61220
• 代理人: 康凱

技術領域

本發明涉及一種生長激素受體激活劑的制備方法。

背景技術

生長激素(Growthhormone，GH)是由垂體分泌的多肽，經循環系統運送至靶器官上發揮相應的生物效應，由191個氨基酸組成.研究表明，GH對動物的生長發育有著極其重要的作用，同時在免疫、生殖、代謝等方面亦有許多重要生理功能，是動物機體最重要的內分泌激素之一。GH生理作用的發揮主要通過生長激素受體(Growthhormonereceptor，GHR)介導。GHR屬于典型的I類生長因子受體，由620個氨基酸組成，包括胞外域、跨膜域和胞內域。GH與相應靶細胞的GHR相結合發揮其生理作用，產生相應的生長因子和免疫調節因子，如胰島素樣生長因子(in-sulin-likegrowthfactors-1，IGFl)、白介素-6(inter-leukin-6，IL6)、白介素-2(interleukin-2，IL2)等，胞內信號轉導路徑主要包括janus激酶(januskianse，JAK)-信號傳導及轉錄激活因子(Signaltransduc-ersandactivatorsoftranscription，STAT)、JAK-絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinki-nase，MAPK)和JAK-細胞外調節蛋白激酶(extra-cellularsignal-regulatedkinases1and2，ERKl/2)途徑，GHR介導信號轉導開啟靶基因通過旁分泌和自分泌的方式發揮相應的生理作用。Cunningham等首次利用晶體試驗證實，-分子GH與兩分子的GHR相結合產生二聚體而激活GHR，其結合位點-個為高親和性的位點(sitel)，一個為低親和性的位點(site2)。Herrington等[81研究表明，GH高親和性位點先與GHR結合，導致GH發生翻轉，再與低親和性位點相結合形成二聚體，進而啟動信號轉導。然而近年來研究表明，僅形成二聚體不足以啟動信號轉導，GH與GHR結合后須經過GHR的旋轉才能啟動信號轉導口。

隨著人們對動物產品安全性要求的逐步提高，動物生產中過量使用激素造成的殘留問題引起社會廣泛關注。外源性的生長激素是被禁止在動物生產中使用的，但GH在動物生長發育過程中具有重要作用，所以研究開發可替代GH的生物制劑尤為重要。本課題組多年來-直致力于GH可替代物的研究，從多個角度研究和開發了GHR激活劑，如使用肽類物質和抗獨特型抗體等，都取得了-定的效果。在筆者嘗試使用新的方法制備GHR激活劑的過程中，通過查閱文獻發現，1991年科學雜志(Science)首先報道了生長激素與其受體的晶體結構(GH-GHR)，晶體結構表面-分子GH與兩分子GHR結合，當時科學家認為GHR的激活機制是二聚化(即1個GH分子將2個GHR分子招募到-起，形成二聚化的受體GH-(GHR)。

研究發現，部分抗GHR抗體能夠使表達有GHR的細胞增殖，但若將抗GHR抗體降解為單價的Fab后，其則失去了促進細胞增殖的功能，這再次驗證了GHR的激活是通過二聚化完成的。此外，Rowlin-son等通過制備-系列的抗GHR抗體，發現部分抗體能夠促進有GHR表達的細胞增殖。Wan等對-個激活性抗GHR單克隆抗體進行表位作圖發現，抗GHR的抗體誘導受體產生相應的構象變化。這-系列研究似乎表明抗GHR抗體能夠激活GHR，為此推測抗GHR抗體也能夠作為GH的模擬物，但目前國內尚未見相關的研究報道。

發明內容

本發明提出一種生長激素受體激活劑的制備方法。

一種生長激素受體激活劑的制備方法，其特征在于包括以下制備步驟：

（1）用含體積分數10％滅活胎牛血清、青霉素100IU/mI.鏈霉素100IU/mL的RP—MI一1640培養基培養CHO～GHR638細胞，培養條件37℃、體積分數5％二氧化碳；

（2）選取6周齡雌性鼠6只，首免以100毫克GHBP與等體積弗氏完全佐劑乳化后免疫BALB/c鼠，免疫劑量為50毫克/只)，并以14d為問隔進行加強免疫，劑量與首免相同，不同的是與弗氏不完全佐劑乳化，每次加強免疫后3d采尾靜脈血測效價，直至效價達到1：20000以上時，取鼠脾臟細胞與SP2/O融合；

（3）將融合后的細胞分散于96孔細胞培養板中，經含有HAT的培養基篩選培養10d后，利用間接ELISA篩選陽性克隆，將陽性克隆轉移到20孔培養板，擴大培養；